衰老的分子調控機制及中藥的干預作用

劉不悔 顧一煌 涂玥 何偉明 吳薇 劉瑩露 萬子玥 萬毅剛??

[摘要]衰老（aging）是生物體組織、器官以及細胞功能隨時間而逐漸喪失的漸進過程。有關衰老分子機制的學說包括經典的“端粒（telomere）學說”、“氧自由基（oxygen radical）學說”、“非酶糖基化（nonenzymatic glycosylation）學說”等，還有新近提出的“DNA甲基化（DNA methylation）學說”、“線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）學說”、“自噬（autophagy）學說”等。最新的研究表明，自噬是造血干細胞對抗衰老的一種有效措施。近年來，基于衰老的分子調控機制而發現了一些很有前途的抗衰老藥物，如煙酰胺單核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）和抗衰老肽——FOXO4DRI。此外，在植物提取物領域中也有很多新發現，其中，以姜黃素（curcumin）、白藜蘆醇（resveratrol）為代表的中藥提取物以及一些單味中藥、經典的中藥復方可以在體內外干預人類衰老的分子調控機制而發揮一定的抗衰老作用。總之，基于衰老分子調控機制而研制或發掘抗衰老藥物，尤其是天然藥物，這是抗衰老研究領域的主要發展方向之一。

[關鍵詞]衰老；中藥；抗衰老；分子機制；自噬

Molecular regulative mechanisms of aging and interventional

effects of Chinese herbal medicine

LIU Buhui1， GU Yihuang2， TU Yue2*， HE Weiming1*，

WU Wei3， LIU Yinglu3， WAN Ziyue4， WAN Yigang5

（1. Department of Nephrology， The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China；

2. Department of Traditional Chinese Medicine Health Preservation， Second Clinic Medical School，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China；

3. Department of Traditional Chinese Medicine， Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Chinese Medicine and Western Medicine，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210008， China；

4. Department of Social Work， Meiji Gakuin University， Tokyo 1088636， Japan；

5. Department of Traditional Chinese Medicine， Nanjing Drum Tower Hospital， The Affiliated Hospital of Nanjing

University Medical School， Nanjing 210008， China）

[Abstract]Aging is a gradual process during the loss of functions in cells，organs and tissues by time The molecular mechanisms of agingrelated theories include the classical ones such as telomere，oxygen radical and nonenzymatic glycosylation，as well as the newly proposed ones such as DNA methylation，mitochondrial DNA （mtDNA）and autophagy The latest study showed the antiaging effect of autophagy in hematopoietic stem cells In recent years，based on the molecular regulative mechanisms of aging，a number of the promising antiaging drugs have been found，including nicotinamide mononucleotide（NMN）and FOXO4DRI，a peptide of antiaging In addition，there are many new discoveries in the field of plant extracts，in which，the extracts from Chinese herbal medicine（CHM），some single CHMs and the classical prescriptions of CHM，represented by curcumin and resveratrol，have the partial antiaging effects by regulating the molecular mechanisms of aging both in vivo and in vitro In brief，developing or exploring antiaging drugs，especially the natural drugs，is one of the main development directions in the field of antiaging research in the basis of the molecular regulative mechanisms of aging.endprint

[Key words]aging； Chinese herbal medicine； antiaging； molecular mechanism； autophagy

目前，隨著全球人口的不斷增長，人口老齡化已經成為嚴重的社會問題，因此，在當今的人類生活和科學研究中，“衰老（aging）和抗衰老（antiaging）”是各個研究領域關注的熱點和焦點[13]。衰老是生物體組織、器官以及細胞功能隨時間而逐漸喪失的漸進過程。縱觀近一個世紀的衰老和抗衰老研究歷程，期間，產生了許多有關衰老分子機制的學說（或假說），其中，包括經典的“端粒學說”、“氧自由基學說”、“非酶糖基化學說”等，還有新近提出的“DNA甲基化學說”、“線粒體DNA學說”、“自噬學說”等（圖1）[4]。近年來，隨著細胞、分子生物學實驗技術的不斷進步，對于衰老的分子調控機制，取得了較為深刻的認識[56]。2017年的最新研究表明，胞內甲基轉移酶SETD8酶可以有效地調節人胚肺成纖維細胞的衰老過程[7]；通過無義介導的mRNA降解而進行RNA質量控制可以明顯延長秀麗隱桿線蟲的壽命[8]。更為重要的是，國外學者基于衰老的相關分子機制而發現了一些很有前途的抗衰老藥物。例如，美國Harvard大學醫學院的著名學者Sinclair教授團隊發現了改善 DNA 修復的革命性抗衰老藥物——煙酰胺單核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN），其作用機制與sirtuins（SIRT17）激活有關[1]；荷蘭Erasmus大學醫學中心Baar等報道[2]，“抗衰老肽——FOXO4DRI”能選擇性地找到并摧毀衰老細胞，其機制是阻斷了衰老相關蛋白FOXO4與P53之間的相互作用。無疑，這些成果使抗衰老化學藥物的研制成為了可能。此外，在植物提取物領域也有很多新發現。以姜黃素（curcumin）[911]、白藜蘆醇（resveratrol）[1213]為代表，國內外學者在中藥提取物、單味中藥以及經典的中藥復方中找到了一些延年益壽的藥物，這些“天然藥物”可以在體內外干預人類衰老的分子調控機制而發揮一定的抗衰老作用。

1端粒學說與衰老以及中藥的干預作用

1938年，英國Edinburgh大學Muller首先發現了端粒（telomere）。它是位于染色體末端的DNA蛋白質復合體，由端粒DNA序列和端粒蛋白構成，其功能是控制細胞分裂周期而維持染色體的完整性[14]。端粒自身也有壽命，細胞每分裂一次，端粒就縮短一次，當端粒不能再縮短時，細胞就無法繼續分裂而死亡[15]。端粒酶（telomerase）是一種由催化蛋白和RNA模板組成的酶，可合成染色體末端的DNA，

決定端粒的長度[16]。研究表明，端粒縮短和端粒酶活性低下是導致衰老的主要驅動因素之一[17]。2017年，美國斯克里普斯研究所的學者發現了一種不同于端粒酶的新型蛋白質——端粒鋅指相關蛋白（telomeric zinc fingerassociated protein，TZAP），它也能夠結合在染色體末端而決定端粒的長度，與衰老的發生密切相關[18]。

端粒學說相關的抗衰老中藥包括鎖陽、當歸以及由人參、何首烏等中藥組成的中藥復方制劑。馬麗杰等觀察鎖陽提取物——鎖陽多糖（Cynomorium songaricum polysaccharide，CSP）對老年小鼠血液和腦組織端粒長度的影響。作者每天給昆明小鼠腹腔注射D半乳糖（500 mg·kg-1）建立衰老模型，以不同劑量CSP（20，40，80 mg·kg-1）灌胃，干預56 d后，采用實時熒光定量PCR測定模型鼠外周血端粒的平均長度；結果顯示，高劑量CSP組（80 mg·kg-1）小鼠外周血T（telomeres）/S（single copy gene）比值顯著高于模型組，此外，高、中、低劑量CSP組小鼠腦組織中T/S值也明顯高于模型組；作者推測，CSP在體內能夠延長衰老模型鼠外周血和腦組織端粒長度，延緩衰老[19]。Zhang等為了探討當歸提取物——當歸多糖（Angelica sinensis polysaccharide，ASP）調控造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）衰老的潛在機制而在體內觀察HSCs端粒長度、端粒酶活性以及衰老相關的P53蛋白表達的改變情況。作者將C57BL/6J小鼠隨機分為青年組、老年組和藥物干預組；老年組小鼠通過X射線照射而建立小鼠HSCs衰老模型，藥物干預組小鼠在X線照射期間經灌胃給予ASP（200 mg·kg-1），青年組小鼠經灌胃給予生理鹽水；結果顯示，與青年組相比，老年組小鼠G1期HSCs細胞比例顯著增加，β半乳糖苷酶染色陽性細胞率和P53蛋白表達水平明顯增高，端粒長度和端粒酶活性降低；與老年組小鼠相比，藥物干預組G1期HSCs細胞比例下降，P53蛋白表達水平下調，端粒長度和端粒酶活性增加。作者推測，ASP可以拮抗X射線誘導的HSCs衰老，其作用是通過延長端粒長度，增加端粒酶活性，下調P53蛋白表達水平而實現的[20]。此外，Yu等報道[21]，由人參、何首烏、杏仁、青皮、厚樸、乳香等中藥組成的天升元口服液1不僅可以增強正常外周血單核細胞和CD34+造血干細胞端粒酶的活性，而且，能夠降低前髓細胞性白血病細胞系HL60細胞端粒酶的活性，其作用呈劑量依賴性；經β半乳糖苷酶染色證實，天升元口服液1調節端粒酶活性的作用與其拮抗細胞衰老密切相關。

2氧自由基學說與衰老以及中藥的干預作用

在氧化損傷過程中，自由基的不完全還原可以產生多種活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括過氧化氫（H2O2）、陰離子自由基超氧化物、羥基自由基以及線粒體中的電子傳遞鏈等[22]。在機體諸多非吞噬細胞中，有一系列煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶催化亞基gp91phox的同源物，統稱為非吞噬細胞NADPH 氧化酶（nonphagocytelike NADPH oxidase，Nox）蛋白家族。Nox和5脂氧合酶是細胞中ROS的主要來源，ROS通過降解不飽和脂質而形成丙二醛（malondialdehyde，MDA），它作為生物體內氧化損傷的標志物，其含量隨細胞衰老而持續增加[23]。基于這些認識，早在1956年，Harman等根據射線損傷存在氧自由基（oxygen radical）增加的現象而提出衰老的氧自由基假說[24]。然而，由于臨床上缺乏明確的抗氧化而延緩衰老的證據，這一假說至今也沒有得到公認。晚近的研究表明，生物體內源性抗氧化系統的公共底物——NADPH氧化酶是抗氧化反應中起關鍵作用的分子，而葡萄糖6磷酸脫氫酶（glucose6phosphate dehydrogenase，G6PD）是細胞內合成NADPH氧化酶的關鍵酶。目前，可以利用轉基因手段促使小鼠在體內大量表達G6PD，提高細胞內NADPH氧化酶含量，從而，增強細胞的自然抗氧化損傷能力，延緩衰老[25]。國內外學者認為，這項研究有力地支持了上述的氧自由基衰老學說。一般來說，抗氧化劑可通過抑制ROS的產生，或者清除已產生的ROS來發揮抗氧化作用，但是，大多數具有抗氧化作用的物質在濃度或條件改變后會誘發促氧化反應。endprint

氧自由基學說相關的抗衰老中藥包括枸杞子和著名經方六味地黃丸。Qi等觀察枸杞子提取物——枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBPs）對氧化損傷誘導人類晶狀體上皮細胞衰老與凋亡的影響。作者用200 μmol·L-1H2O2刺激SRA01/04細胞（人晶狀體上皮細胞系），而后，將這些細胞隨機分為對照組與干預組，干預組給予LBPs處理；結果表明，LBPs不僅能顯著降低H2O2誘導的細胞凋亡、ROS累積、線粒體膜電位丟失以及MDA含量，還能改善H2O2誘導的Bcl2和Bax蛋白表達水平，并且，提高抗氧化酶的活性。此外，LBPs還能延緩H2O2誘導的細胞衰老[26]。Tseng等研究六味地黃丸對帕金森（Parkinson′s disease，PD）神經元退行性病變和凋亡的影響。作者用100 μmol·L-11甲基4苯基吡啶（1methyl4phenylpyridinium，MPP+）干預原代中腦神經元48 h而誘導其發生退行性病變，而后，將神經元分為對照組和干預組，用不同劑量的六味地黃丸水煎液（001，01，1，10 mg·L-1）預處理干預組神經元1 h；結果顯示，六味地黃丸水煎液不僅能減少MPP+誘導的ROS產生，上調NADPH氧化酶的表達，增強神經元的抗氧化能力，還能提高線粒體膜電位，調節凋亡相關蛋白Bcl2，Bax，細胞色素C和cleavedcaspase3的表達。作者認為，六味地黃丸在體外可以改善PD神經元退行性病變[27]。

3非酶糖基化學說與衰老以及中藥的干預作用

非酶糖基化（nonenzymatic glycosylation，NEG）是以還原糖和生物大分子（蛋白質、脂質、核酸）為核心反應物的一類生化反應，不需要酶催化，最終會形成晚期糖基化終產物（advanced glycation endproducts，AGEs）[28]。研究表明，AGEs可與生物大分子結合而形成脂褐質（老年斑），還可與膠原彈力蛋白等結合而使富含結締組織的皮膚、肌腱和血管失去彈性，出現老化[29]。此外，AGEs在體內通過其受體（receptor of AGE，RAGE）依賴途徑影響NADPH氧化酶和其他的胞內信號轉導通路，促進氧自由基生成，加速衰老[30]。

非酶糖基化學說相關的抗衰老中藥包括紅景天以及由人參、三七、川芎等組成的中藥復方制劑。Mao等觀察紅景天提取物——紅景天苷（salidroside）對D半乳糖誘導的小鼠衰老模型的抑制作用。作者選用5月齡C57BL/6J小鼠，隨機分為4組（對照組、D半乳糖組、D半乳糖聯合紅景天苷組以及紅景天苷組），經藥物干預8周后，其結果顯示，對于D半乳糖誘導的衰老模型鼠，紅景天苷能夠有效地抑制血清AGEs含量，逆轉神經系統的衰老性改變，增強淋巴細胞的有絲分裂，提高白細胞介素2（interleukin，IL2）水平；此外，紅景天苷還能明顯下調衰老模型鼠大腦皮質中膠質纖維酸性蛋白、神經營養因子3蛋白表達水平。作者認為，紅景天苷在體內能夠抑制AGEs而拮抗D半乳糖誘導的神經系統衰老[31]。雷燕等探討老年小鼠的血管老化特征以及人參、三七和川芎提取物的聯合干預作用。作者選擇自然衰老模型鼠，用維生素E和不同劑量的中藥混合提取物進行干預；結果顯示，對于自然衰老模型鼠，高、中、低劑量的中藥混合提取物均能減少血管組織中AGEs和ROS的含量，而高劑量中藥混合提取物能明顯減輕血管內皮細胞和平滑肌細胞的增殖，降低血管組織中膠原纖維的含量，改善血管老化[32]。

4DNA甲基化與衰老以及中藥的干預作用

所謂DNA甲基化（DNA methylation）就是指在DNA甲基化轉移酶（DNA methyltransferase，Dnmt）的作用下將甲基選擇性地添加到胞嘧啶上而形成5甲基胞嘧啶（5methylcytosine，5mC）的過程[33]。研究表明，在衰老細胞中，5mC總含量降低，這種去甲基化有可能引起染色體的不穩定和重排，并且，使細胞出現衰老表型[34]。因此，DNA甲基化被認為是細胞衰老的主要特征之一。Hannum等收集年齡在19～101歲的656位健康人的血液樣本而檢測其DNA甲基化標志；結果顯示，健康人群的DNA甲基化會隨年齡增長而發生改變，同時，還會受到性別和基因組遺傳變異的影響，DNA甲基化能夠顯示不同個體衰老的快慢程度和不同器官的老化速度[35]。

DNA甲基化學說相關的抗衰老中藥包括著名經方左歸丸和人參湯。龔張斌等選用90只正常大鼠，建立自然衰老模型，觀察左歸丸對模型鼠衰老以及外周血T細胞DNA甲基化的影響。作者將模型鼠隨機分為青年對照組、老年對照組以及老年左歸組（各30只），從各組大鼠外周血中提取CD4+細胞，并接受抗CD3抗體和抗CD28抗體的共同干預（24 h），檢測IL2 核酸（mRNA）表達水平、DNA甲基轉移酶水平以及IL2基因啟動子區G位點甲基化水平；結果顯示，左歸丸有延緩老年大鼠外周血CD4+細胞衰老的作用，其機制與增強CD4+細胞活性，降低DNA甲基轉移酶水平，抑制IL2基因SET1區域甲基化水平有關[36]。陳比特等觀察人參湯聯合茶多酚（綠茶提取物）的抗衰老作用。作者首先用茶多酚聯合人參湯干預老年小鼠，并且，分別與青年小鼠和接受安慰劑的老年小鼠做對照；其次，檢測各組小鼠肝細胞DNA甲基化轉移酶，并評估其活性；結果表明，對于特定濃度的茶多酚聯合人參湯干預的小鼠，其肝細胞DNA甲基化轉移酶水平及活性明顯增強。作者推測，特定濃度的茶多酚聯合人參湯可以延緩肝細胞衰老[37]。

5線粒體DNA與衰老以及中藥的干預作用

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是唯一的核外遺傳物質，當它暴露于高ROS環境中，可致其突變和缺失而引起線粒體類疾病或衰老[38]，這可能與其在氧化微環境中保護性組蛋白修飾丟失而影響核內DNA修復機制有關[39]。借助去除線粒體DNA聚合酶γ的小鼠，mtDNA損傷引起的過早老化和壽命縮短現象被相繼確認。近年來，在衰老相關的神經和運動障礙性疾病領域，mtDNA 異質性（突變型mtDNA與野生型 mtDNA 共存的現象）作為簡單而無創的衰老預測因子得到廣泛關注[40]。endprint

線粒體DNA學說相關的抗衰老中藥包括著名經方五子衍宗丸和松花粉。王學美等觀察五子衍宗丸對老年大鼠mtDNA缺失和線粒體復合酶活力的影響；作者發現，對于自然衰老的老年大鼠（22月齡），高劑量的五子衍宗丸懸濁液可減少腦組織mtDNA缺失，提高線粒體呼吸鏈復合酶活性，延緩腦組織衰老[41]。喻陸等研究松花粉對老年小鼠腎組織mtDNA缺失和突變的影響；作者將昆明老年小鼠隨機分為松花粉組、老年對照組和年輕對照組；松花粉組小鼠每天經灌胃給予松花粉（750 mg·kg-1），年輕對照組和老年對照組小鼠經灌胃給予生理鹽水；干預60 d后，檢測模型鼠腎組織內mtDNA缺失、突變情況以及MDA含量；結果顯示，老年對照組小鼠腎組織內mtDNA表達和缺失水平明顯升高；與老年對照組相比，松花粉組小鼠腎組織mtDNA缺失較少，MDA含量明顯降低。作者認為，松花粉能夠抑制老年小鼠腎組織mtDNA缺失和突變，這可能是其拮抗腎臟衰老的機制之一[42]。

6自噬學說以及中藥的干預作用

自噬（autophagy）是細胞對抗惡劣環境的重要手段。在營養缺乏或高溫氧化等惡劣環境下，細胞可以啟動自噬而達到保護自身的目的[43]。2017年的最新研究顯示，自噬也是許多物種對抗衰老的一種有效措施。Ho等發現，造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）失去自噬作用會出現明顯的老化現象，包括胞內線粒體累積的增加、代謝水平的升高以及細胞自身更新和再生能力的降低等[44]。對于包括干細胞在內的各種細胞而言，新陳代謝率降低是其衰老的共性特征，代謝廢物無法在胞中得到及時清除，必將損傷細胞功能，降低細胞活性，縮短細胞壽命；而自噬可以及時降解受損的蛋白質，清除胞內廢物，維護細胞功能，延長細胞壽命[45]。因此，自噬可以調控細胞衰老。在這一調控過程中，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）及其相關信號途徑發揮了重要作用，其中，涉及腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）/mTOR通路[46]、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3kinase，PI3K）/絲氨酸蘇氨酸激酶（serinethreonine kinase，Akt）/mTOR通路[47]、AMPK/沉默信息調節因子1（silent information regulation 1，Sirt1）通路[48]以及轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGFβ）/Smad通路[4950]等。研究顯示，調控這些信號途徑的關鍵信號分子就可以抗衰老（圖2）。

自噬學說相關的抗衰老中藥包括虎杖、姜黃以及冬蟲夏草等。Zhang等報道[5152]，腎小球系膜細胞在高濃度葡萄糖（30 mmol·L-1）刺激96 h后，其Sirt1活性受到顯著抑制，干擾自噬過程，誘導細胞衰老；經1 mg·L-1白藜蘆醇干預后，Sirt1活性顯著提高，細胞衰老得到明顯改善。李春花等人采用腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導糖尿病大鼠衰老模型，每日用白藜蘆醇（20 mg·kg-1）給模型鼠灌胃，連續干預12周；作者發現，自噬相關蛋白Ⅱ型LC3以及Beclin1表達明顯上調，模型鼠臟器衰老明顯好轉[53]。Gu等報道[54]，在注射阿霉素腎病大鼠模型中，AMPK活性降低，腎臟細胞凋亡，腎臟衰老；給予白藜蘆醇干預后，AMPK/mTOR信號通路激活，細胞自噬蛋白表達增加，細胞凋亡改善，腎臟衰老好轉。Xu等發現，經H2O2刺激后的腎小球系膜細胞，在姜黃素干預后，其自噬標志性蛋白Ⅱ型LC3表達明顯增加，腎臟病理性損傷和衰老指標顯著改善[55]。此外，對于糖尿病腎病患者而言，由腎臟分泌的抗衰老激素——分泌性Klotho蛋白能夠抑制機體衰老，并保護心血管、腎臟等系統的功能。黃可等報道[56]，STZ誘導的糖尿病大鼠模型，其腎組織內Klotho蛋白表達明顯下降，經冬蟲夏草灌胃干預24周后，腎組織Klotho蛋白表達呈上升趨勢，機體和腎臟衰老得到延緩。

綜上所述，有關衰老分子機制的學說包括“端粒學說”、“氧自由基學說”、“非酶糖基化學說”、“DNA甲基化學說”、“線粒體DNA學說”以及“自噬學說”等，令人遺憾的是，迄今為止，還沒有一個學說可以全面而準確地解釋衰老及其相關的分子機制。近年來，對于衰老分子調控機制的認識取得了長足的進步，但是，基于人類在日常生活中對于抗衰老的需求，在臨床上找到有效的生物標志物來幫助確定復雜的衰老過程并進行有效的干預，這一點更為重要。研究表明，經典的衰老標志物包括血液中的脂質、多肽和激素等；新近發現的衰老標志物包括microRNA、膽紅素和AGEs等[6]。對于這些簡單而明了的衰老標志物，其臨床價值如何評估？它們與已知的衰老分子機制是否有明確的相關性？在臨床上或日常生活中，是否能借助藥物或保健品，尤其是抗衰老的植物提取物而進行有效地干預或調控呢？筆者認為，這是抗衰老研究領域亟待解決的問題，也是其今后的發展方向之一。眾所周知，抗衰老屬于中醫養生學范疇。明代的著名醫家虞摶在《醫學正傳》中指出：“腎氣盛則壽延，腎氣衰則壽夭”。因此，自古以來“補腎固精”就是中醫養生（抗衰老）的根本大法。筆者相信，相比于白藜蘆醇、姜黃素等中藥提取物，具有補腎固精等功效的單味中藥（冬蟲夏草等）和經典的中藥復方（六味地黃丸、五子衍宗丸等）應該有更好的抗衰老作用。此外，筆者認為，衰老不僅源于“腎虛”，還與“瘀血”等病理產物密切相關。“祛瘀生新”也是中醫抗衰老的重要治法之一。筆者發現，“祛瘀生新”代表性中藥大黃及其有效單體成分大黃酸能減輕D半乳糖誘導的腎小管上皮細胞衰老，其分子機制可能與腎臟自噬信號通路[5758]有關。

[參考文獻]endprint

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[責任編輯張寧寧]endprint