高效液相色譜法測定飼料中乳酸鈣含量

摘要：建立了飼料中乳酸鈣的高效液相色譜分離檢測方法。試樣用水超聲萃取，以甲醇-0.05%磷酸作為流動相，使用光電二極管陣列檢測器進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，乳酸鈣在0.0375～1.5 mg/mL內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)為1.0000，乳酸鈣的檢出限為0.11 mg/g，定量限為0.36 mg/g，回收率為82.9%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.71～2.2%。該方法定量準(zhǔn)確可靠，重復(fù)好，回收率高，適用于飼料樣品中乳酸鈣的日常測定。

關(guān)鍵詞：飼料；乳酸鈣；高效液相色譜

動物產(chǎn)蛋階段以及幼仔成長前期階段對鈣的需求較大，而飼料原料中鈣含量少，玉米含鈣量僅為0.02%，豆粕含鈣量為0.33%，需要額外添加礦物質(zhì)鈣才能滿足其對鈣的營養(yǎng)需要[1]。乳酸鈣作為優(yōu)質(zhì)鈣源，早已經(jīng)被國家批準(zhǔn)作為飼料添加劑用于飼料產(chǎn)品中，有文獻(xiàn)表明產(chǎn)蛋雞在初產(chǎn)后飼喂添加有乳酸鈣的飼料，可以提高其產(chǎn)蛋率[2]。目前對飼料以及藥品中乳酸鈣的檢測方法主要為滴定法[3-5]。其原理利用乳酸鈣可在熱水中迅速溶解， 并離解成鈣離子和乳酸根離子，鈣離子可迅速與乙二胺四乙酸二鈉反應(yīng)， 以鈣—羥酸為指示劑， 用EDT A 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定， 溶液成純藍(lán)色為滴定終點(diǎn)， 用滴定消耗的EDTA 的體積和摩爾濃度可求得乳酸鈣的含量。由于飼料中常含有多種鈣源，如碳酸氫鈣，甲酸鈣，乳酸鈣等均易溶于水，其他鈣源容易對滴定法造成干擾，造成定量不準(zhǔn)確。高效液相色譜法具有分離效率高，選擇性好，檢測靈敏度高等特點(diǎn)，是常用的檢測方法，已經(jīng)被用于保健品中多種鈣源的分離檢測[6]。目前利用高效液相色譜法測定飼料中乳酸鈣的檢測方法還未見相關(guān)報道。本文采用高效液相色譜建立起簡單、快速， 準(zhǔn)確的飼料中乳酸鈣分離檢測技術(shù)。該方法的建立可為飼料產(chǎn)品中乳酸鈣的生產(chǎn)、應(yīng)用提供有效的技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀配光電光電二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；DS-8510超聲波發(fā)生器（上海生析超聲儀器有限公司）；Milli Q超純水制備器（美國Milipor公司）

甲醇，色譜純（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司），其它試劑為分析純。

乳酸鈣（純度≥98.0%，含水率為25%）購于上海源葉生物有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和工作溶液配制

乳酸鈣標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品1.0g，用超純水溶解并定容至100 mL，配制成濃度為7.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：將乳酸鈣的標(biāo)準(zhǔn)儲備液采用逐級稀釋的方法配制濃度從0.0375 mg/mL到1.5 mg/mL之間的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，所有標(biāo)準(zhǔn)儲備液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均置于冰箱中0 ℃ ～ 4 ℃溫度下保存。

1.3 樣品前處理

稱取飼料樣品0.1g（精確至0.0001g）于100 mL的燒杯中，加入50 mL超純水，于超聲波振蕩器中超聲萃取20 min后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加入200 g/L乙酸鋅溶液和100 g/L亞鐵氰化鉀溶液各1 mL沉淀蛋白，超純水混勻定容至刻度。提取液經(jīng)10000 r/min離心5 min后，取上清液，以0.45 μm濾膜過濾，濾液供分析用。

1.4 色譜條件

色譜柱：XB-C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Welch公司）；柱溫： 35℃；檢測波長210 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量25 μL。流動相：A，0.05%磷酸溶液；B，甲醇。梯度洗脫程序：0～9.0 min，100%A；9.0～9.1 min，100%A ～40%A ； 9.1～12 min，保持40%A ； 12.0～12.1 min，40%A ～100%A；12.1～15 min，保持100%A。

2 結(jié)果與討論

2. 1 色譜條件優(yōu)化

C18色譜柱以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(tuán)（ODS），固定相較為穩(wěn)定，被廣泛運(yùn)用。本方法采用C18柱可以很好地將乳酸鈣與其它化合物分離。同時實(shí)驗(yàn)比較了甲醇/水和甲醇/0.05%磷酸溶液兩種流動相體系，在甲醇/0.05%磷酸溶液流動相體系下，目標(biāo)物乳酸鈣具有更好的峰型，因而選擇后者作為流動相。乳酸鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖、飼料空白樣品色譜圖和飼料樣品加標(biāo)色譜圖見圖1。

2. 2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

乳酸鈣具有較好的水溶性，實(shí)驗(yàn)結(jié)合超聲波振蕩器可充分萃取飼料樣品中的乳酸鈣。提取液中的蛋白質(zhì)等化合物可能會對測定樣品中的乳酸鈣產(chǎn)生干擾，實(shí)驗(yàn)通過選用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀作為沉淀劑，降低了其他化合物對檢測準(zhǔn)確性的影響。

2.3 線性方程、線性關(guān)系、檢出限及定量限

配制乳酸鈣各濃度為0.0375 mg/mL到1.5 mg/mL之間的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以乳酸鈣的峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸，線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限。結(jié)果表明，乳酸鈣在0.0375 mg/mL～1.5 mg/mL內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.9995。以3倍信噪比（S/N=3）為檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）為定量限，乳酸鈣的檢出限為0.11 mg/g，定量限為0.36 mg/g。

2.4 回收率和精密度

在優(yōu)化后的測試條件下，取空白飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率測試，加標(biāo)水平分別為103 mg/g，316 mg/g，632 mg/g，每個水平重復(fù)分析6次。從該方法的加標(biāo)回收率為82.9%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.71～2.2%。結(jié)果表明，該方法適用于飼料中乳酸鈣的日常分析檢測。

2.5 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法對一市售乳酸鈣陽性飼料樣品進(jìn)行檢測，重復(fù)性條件下測定六次，含量分別為638 mg/g，641 mg/g，639 mg/g，645 mg/g，634 mg/g，636 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.61%。

3 結(jié)論

本文采用超聲萃取法結(jié)合高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器，建立了飼料中乳酸鈣含量的測定方法。該方法操作簡單，準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，適用于飼料樣品中乳酸鈣含量的測定。

作者簡介：

白洋（1987-11），男，內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市，天津中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，助理工程師，研究方向：食品與飼料安全檢測.