高效液相色譜法測定飼料中乳酸鈣含量

摘要：建立了飼料中乳酸鈣的高效液相色譜分離檢測方法。試樣用水超聲萃取，以甲醇-0.05%磷酸作為流動相，使用光電二極管陣列檢測器進行檢測。結果表明，乳酸鈣在0.0375～1.5 mg/mL內具有良好的線性關系，且相關系數為1.0000，乳酸鈣的檢出限為0.11 mg/g，定量限為0.36 mg/g，回收率為82.9%～102%，相對標準偏差為0.71～2.2%。該方法定量準確可靠，重復好，回收率高，適用于飼料樣品中乳酸鈣的日常測定。

關鍵詞：飼料；乳酸鈣；高效液相色譜

動物產蛋階段以及幼仔成長前期階段對鈣的需求較大，而飼料原料中鈣含量少，玉米含鈣量僅為0.02%，豆粕含鈣量為0.33%，需要額外添加礦物質鈣才能滿足其對鈣的營養需要[1]。乳酸鈣作為優質鈣源，早已經被國家批準作為飼料添加劑用于飼料產品中，有文獻表明產蛋雞在初產后飼喂添加有乳酸鈣的飼料，可以提高其產蛋率[2]。目前對飼料以及藥品中乳酸鈣的檢測方法主要為滴定法[3-5]。其原理利用乳酸鈣可在熱水中迅速溶解， 并離解成鈣離子和乳酸根離子，鈣離子可迅速與乙二胺四乙酸二鈉反應， 以鈣—羥酸為指示劑， 用EDT A 標準溶液滴定， 溶液成純藍色為滴定終點， 用滴定消耗的EDTA 的體積和摩爾濃度可求得乳酸鈣的含量。由于飼料中常含有多種鈣源，如碳酸氫鈣，甲酸鈣，乳酸鈣等均易溶于水，其他鈣源容易對滴定法造成干擾，造成定量不準確。高效液相色譜法具有分離效率高，選擇性好，檢測靈敏度高等特點，是常用的檢測方法，已經被用于保健品中多種鈣源的分離檢測[6]。目前利用高效液相色譜法測定飼料中乳酸鈣的檢測方法還未見相關報道。本文采用高效液相色譜建立起簡單、快速， 準確的飼料中乳酸鈣分離檢測技術。該方法的建立可為飼料產品中乳酸鈣的生產、應用提供有效的技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀配光電光電二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；DS-8510超聲波發生器（上海生析超聲儀器有限公司）；Milli Q超純水制備器（美國Milipor公司）

甲醇，色譜純（山東禹王實業有限公司），其它試劑為分析純。

乳酸鈣（純度≥98.0%，含水率為25%）購于上海源葉生物有限公司。

1.2 標準儲備液和工作溶液配制

乳酸鈣標準儲備液的配制：準確稱取標準品1.0g，用超純水溶解并定容至100 mL，配制成濃度為7.5 mg/mL的標準儲備液。

標準工作溶液的配制：將乳酸鈣的標準儲備液采用逐級稀釋的方法配制濃度從0.0375 mg/mL到1.5 mg/mL之間的系列標準工作溶液，所有標準儲備液和標準工作溶液均置于冰箱中0 ℃ ～ 4 ℃溫度下保存。

1.3 樣品前處理

稱取飼料樣品0.1g（精確至0.0001g）于100 mL的燒杯中，加入50 mL超純水，于超聲波振蕩器中超聲萃取20 min后，轉移至100 mL容量瓶中，加入200 g/L乙酸鋅溶液和100 g/L亞鐵氰化鉀溶液各1 mL沉淀蛋白，超純水混勻定容至刻度。提取液經10000 r/min離心5 min后，取上清液，以0.45 μm濾膜過濾，濾液供分析用。

1.4 色譜條件

色譜柱：XB-C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Welch公司）；柱溫： 35℃；檢測波長210 nm；流速1.0 mL/min；進樣量25 μL。流動相：A，0.05%磷酸溶液；B，甲醇。梯度洗脫程序：0～9.0 min，100%A；9.0～9.1 min，100%A ～40%A ； 9.1～12 min，保持40%A ； 12.0～12.1 min，40%A ～100%A；12.1～15 min，保持100%A。

2 結果與討論

2. 1 色譜條件優化

C18色譜柱以硅膠為基質，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團（ODS），固定相較為穩定，被廣泛運用。本方法采用C18柱可以很好地將乳酸鈣與其它化合物分離。同時實驗比較了甲醇/水和甲醇/0.05%磷酸溶液兩種流動相體系，在甲醇/0.05%磷酸溶液流動相體系下，目標物乳酸鈣具有更好的峰型，因而選擇后者作為流動相。乳酸鈣標準溶液色譜圖、飼料空白樣品色譜圖和飼料樣品加標色譜圖見圖1。

2. 2 前處理條件優化

乳酸鈣具有較好的水溶性，實驗結合超聲波振蕩器可充分萃取飼料樣品中的乳酸鈣。提取液中的蛋白質等化合物可能會對測定樣品中的乳酸鈣產生干擾，實驗通過選用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀作為沉淀劑，降低了其他化合物對檢測準確性的影響。

2.3 線性方程、線性關系、檢出限及定量限

配制乳酸鈣各濃度為0.0375 mg/mL到1.5 mg/mL之間的系列標準工作溶液，以乳酸鈣的峰面積對濃度進行線性回歸，線性方程、相關系數、檢出限及定量限。結果表明，乳酸鈣在0.0375 mg/mL～1.5 mg/mL內具有很好的線性關系，相關系數r為0.9995。以3倍信噪比（S/N=3）為檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）為定量限，乳酸鈣的檢出限為0.11 mg/g，定量限為0.36 mg/g。

2.4 回收率和精密度

在優化后的測試條件下，取空白飼料樣品進行加標回收率測試，加標水平分別為103 mg/g，316 mg/g，632 mg/g，每個水平重復分析6次。從該方法的加標回收率為82.9%～102%，相對標準偏差RSD為0.71～2.2%。結果表明，該方法適用于飼料中乳酸鈣的日常分析檢測。

2.5 實際樣品分析

應用本方法對一市售乳酸鈣陽性飼料樣品進行檢測，重復性條件下測定六次，含量分別為638 mg/g，641 mg/g，639 mg/g，645 mg/g，634 mg/g，636 mg/g，相對標準偏差為0.61%。

3 結論

本文采用超聲萃取法結合高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器，建立了飼料中乳酸鈣含量的測定方法。該方法操作簡單，準確可靠，靈敏度高，適用于飼料樣品中乳酸鈣含量的測定。

作者簡介：

白洋（1987-11），男，內蒙古自治區呼和浩特市，天津中醫藥大學碩士研究生，助理工程師，研究方向：食品與飼料安全檢測.