不同免疫抑制劑及甲潑尼龍對小鼠肺間質纖維化的療效對比

趙麗珂,穆冰瑤,周榮偉,程永靜,黃慈波

(北京醫院風濕免疫科 國家老年醫學中心，北京 100730)

·基礎研究·

不同免疫抑制劑及甲潑尼龍對小鼠肺間質纖維化的療效對比

趙麗珂,穆冰瑤,周榮偉,程永靜,黃慈波

(北京醫院風濕免疫科 國家老年醫學中心，北京 100730)

目的比較環磷酰胺、來氟米特和甲潑尼龍對博來霉素誘導的肺間質纖維化小鼠模型的療效。方法將75只C57BL/6小鼠隨機分成空白組、模型組、環磷酰胺組、來氟米特組及甲潑尼龍組(n=15)。空白組氣管內注入0.9%氯化鈉注射溶液0.2 mL，其余5組氣管內注入博來霉素(5 mg/kg)建立肺纖維化模型，24 h后分別對空白組、模型組每日用0.2 mL 0.9%氯化鈉注射溶液灌胃，藥物組每日分別用環磷酰胺 (50 mg/kg)、來氟米特 (4 mg/kg)和甲潑尼龍灌胃(10 mg/kg)。并于造模后第7、14、28 天分批處死小鼠，取小鼠肺臟評估肺泡炎程度及纖維化的程度。結果(1)博來霉素誘導組小鼠體質量較對照組減輕(P<0.05),環磷酰胺、來氟米特組和甲潑尼龍組小鼠在第7、14、28天小鼠體質量較模型組均明顯增加(P<0.05)。(2)與模型組相比，環磷酰胺組與甲潑尼龍組小鼠7天、14天時肺泡炎評分降低(P<0.05)；第7天、14天、28天時纖維化評分明顯降低(P<0.05)。而來氟米特組小鼠肺泡炎及纖維化評分較模型組差異無統計學意義。結論環磷酰胺和甲潑尼龍能顯著降低博來霉素誘導的小鼠肺間質纖維化，減輕肺組織肺泡炎及肺纖維化程度，但來氟米特沒有類似作用。

肺纖維化；免疫抑制劑；激素類；博來霉素；環磷酰胺；甲潑尼龍

間質性肺病 (ILD)指主要累及肺間質、肺泡和(或)細支氣管的一組肺部彌漫性疾病[1]。目前發現部分肺間質纖維化常繼發于結締組織病(CTD)如類風濕關節炎、系統性硬化癥、系統性紅斑狼瘡、多肌炎/皮肌炎等。有文獻證實，15%的ILD是由CTD引起的[2]，稱之為結締組織病相關的間質性肺疾病(CTD-ILD)，它是CTD 呼吸系統并發癥的重要臨床表現之一，也是引起死亡的重要原因。CTD-ILD中無論非特異性間質性肺炎或尋常型間質性肺炎，其病理學特征早期均可見炎性細胞浸潤，隨之才是成纖維細胞增生和膠原沉積。間質纖維化一旦形成，將不可逆地導致嚴重的甚至威脅生命的呼吸循環功能障礙。目前，國內外對于肺纖維化的治療效果并不理想，且存在各種爭議；而動物模型可以幫助觀察不同的藥物對肺間質纖維化的治療效果，目前，國際上應用最為廣泛的是博來霉素誘導的肺纖維化動物模型[3]。本研究擬采用氣管內滴注博來霉素的方法建立小鼠肺間質纖維化模型，探討常用于結締組織病藥物環磷酰胺、來氟米特及激素對于博來霉素誘導的肺間質纖維化小鼠模型的療效差異。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級C57BL/6，雄性小鼠，5周齡。購于北京維通利華公司，飼養于北京朝陽醫院醫學研究中心動物室。

1.2 藥物與試劑 博來霉素A5(15 毫克/支，日本化藥株式會社產)；小鼠細胞因子/趨化因子磁珠檢測試劑盒(購于上海升聯醫療器械有限公司)；Masson染色試劑盒(購自福州邁新生物技術開發有限公司)。

1.3 動物模型建立及給藥 將75只C57BL/6小鼠用苦味酸進行編號標記，然后使用隨機數字表法進行分組，隨機分成空白組、模型組、環磷酰胺組、來氟米特組及甲潑尼龍組(每組15只)。小鼠在實驗室飼養一周后，采用4%水合氯醛0.1mL腹腔注射麻醉，無菌條件下作氣管切開，空白組氣管內注入0.9%氯化鈉注射溶液0.2 mL，其余5組所有小鼠(模型組和藥物組)氣管內一次性給予博來霉素0.2 mL(5 mg/kg)制作實驗動物模型。

于造模后第2天起，空白組和模型組每日給予0.2 mL 0.9%氯化鈉注射溶液灌胃，艾拉莫德組每日給予0.2 mL艾拉莫德灌胃(90 mg/kg)，環磷酰胺組每周給予0.2 mL環磷酰胺灌胃(50 mg/kg)，來氟米特組每日給予0.2 mL來氟米特灌胃(4 mg/kg)，甲潑尼龍組每日給予甲潑尼龍0.2 mL(10 mg/kg)灌胃。期間每天觀察小鼠體質量、食欲和活動等。

1.4 標本收集 五組小鼠分別于造模后第7、14、28天隨機死5只小鼠(每次每組隨機抽取5只小鼠)，開胸取肺并稱重，切取右肺葉置于10%的甲醛溶液中固定，然后進行HE染色及Masson染色，光學顯微鏡下觀察肺組織病理結構變化。同時摘除小鼠眼球取血行細胞因子檢測。

1.5 細胞因子檢測 血清細胞因子檢測步驟根據Mouse Luminex Screening Assay試劑盒說明書進行，方法為ELISA檢測法。

1.6 結果判定標準 病理學評分根據Szapiel等[4]報道的方法確定肺泡炎和肺纖維化的程度，將肺泡炎和肺纖維化分級并計算積分進行分析。1級：1分，無肺泡炎；2級：2分，輕度肺泡炎和肺間質纖維化，單核細胞浸潤使肺泡間隔增寬僅限于局部，面積不到全肺的20%，肺泡結構正常；3級：3分，中度肺泡炎和肺間質纖維化，面積占全肺的20%～50%；4級：4分，重度肺泡炎和肺間質纖維化，面積超過全肺的50%，偶見肺泡腔內有單核細胞及出血造成。

2 結果

2.1 一般情況及體質量 體質量資料列表，經整體分析(單因素方差分析)，除0天外，其余時間點，五個組的整體差異有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較并結合主要情況來看：空白組小鼠生長良好，除體質量自然增長外，其他無異常改變；博來霉素誘導的C57BL/6小鼠活動減少，飲食進水較前減少，部分小鼠可見皮毛暗淡無光澤，皮毛紊亂甚至伴有脫毛現象。與空白組對比，模型組、環磷酰胺組、來氟米特組和甲潑尼龍組在第7、14、28天小鼠體質量下降(P<0.05)；與模型組對比，環磷酰胺組小鼠第7、14天重低于模型組小鼠體質量但差異無統計學意義，第28天體質量有所增加(P<0.05)，甲潑尼龍組小鼠在第7、14、28天小鼠體質量均明顯增加(P<0.05)，來氟米特組與模型組相比體質量差異無統計學意義。見表1。

2.2 小鼠肺組織HE染色情況及肺泡炎評分

2.2.1 小鼠肺組織HE染色情況 各組小鼠肺組織HE染色顯示(圖1)：(1)空白組：肺泡間隔和肺泡腔內未見炎性細胞浸潤，肺泡間隔未見增厚，無新生血管形成。(2)模型組：第7天肺泡間隔和肺泡腔內有炎性細胞浸潤，以單核巨噬細胞為主，成纖維細胞逐漸增多；第14天肺泡萎縮壓扁、間隔增寬，肺泡上皮腫脹，炎性細胞浸潤較明顯，成纖維細胞明顯增多并可見纖維組織增生，出現肺纖維化改變；第28天肺泡間隔炎性細胞減少，但肺泡結構破壞，纖維組織呈條索樣瘢痕改變，肺間質纖維化形成。(3)來氟米特組在第7、14、28天病理變化同模型組變化基本相同；(4)環磷酰胺組及甲潑尼龍組第7、14天肺泡萎縮不明顯，間隔略增寬，肺泡上皮略顯腫脹，炎性細胞浸潤減少，成纖維細胞較少；第28天部分肺泡結構破壞，局部肺間質有成纖維細胞聚集，形成輕中度肺間質纖維化。

表1 五組小鼠不同時間體質量變化比較

注： 兩兩比較為HSD-q檢驗；與對照組比較，aP<0.05;與模型組比較，bP<0.05;與環磷酰胺組比較，cP<0.05;與來氟米特組比較，dP<0.05

與空白組相比，博來霉素誘導組小鼠(模型組、 環磷酰胺組、來氟米特組及甲潑尼龍組)肺部肺泡炎癥程度均增加。與模型組相比，來氟米特組小鼠肺部病變程度同模型組基本相似，但環磷酰胺組和甲潑尼龍組小鼠肺部病變較模型組有明顯減輕。

2.2.2 小鼠肺組織肺泡炎評分 如表2所示，整體分析，差異有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較并結合主要數據分析：使用博來霉素誘導的各組小鼠模型(模型組、 環磷酰胺組、來氟米特組及甲潑尼龍組)肺泡炎在7、14、28 d炎癥評分均明顯高于對照組(P<0.05)。環磷酰胺組與甲潑尼龍組7 d、14 d時肺泡炎程度評分較模型組減輕(P<0.05)；28 d時與模型組肺泡炎程度差異無統計學意義(P>0.05)。環磷酰胺組和甲潑尼龍組兩組之間肺泡炎程度差異無統計學意義(P>0.05)。來氟米特組7天、14天、28天與模型組肺泡炎程度比較均差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 小鼠肺組織Masson染色情況 各組小鼠肺組織Masson染色顯示(圖2)：膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色，紅細胞呈橘紅色，細胞核呈藍黑色。空白組：肺組織無明顯變化，僅于大氣道和血管壁周圍可見少量藍色的基質膠原纖維。模型組：第7天小鼠肺間質、和肺泡間隔可見藍色膠原沉積；第14天可見呈小灶樣藍色的膠原纖維；第28天肺間質膠原增生沉積呈彌漫性，并伴有肺泡的融合。來氟米特組肺組織病理改變基本同模型組，環磷酰胺組與甲潑尼龍組肺組織病理改膠原纖維沉積程度較模型組減輕，成纖維細胞灶均有所減少。與空白組對比，灌注博來霉素各組Masson染色顯示的膠原沉積程度均增加。

表2 肺組織病變HE染色評分比較分)

注： 兩兩比較為HSD-q檢驗；與對照組比較，aP<0.05;與模型組比較，bP<0.05;與環磷酰胺組比較，cP<0.05;與來氟米特組比較，dP<0.05

2.4 小鼠肺組織肺纖維化評分 整體比較得知，五組各時間點處整體差異有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較并結合主要數據分析：使用博來霉素誘導的各組小鼠模型(模型組、 環磷酰胺組、來氟米特組及甲潑尼龍組)肺纖維化在7、14、28天評分均明顯高于對照組(P<0.05)。來氟米特組7天時較模型組纖維化程度減輕(P<0.05)，14天、28天較模型組纖維化程度差異無統計學意義(P>0.05)；環磷酰胺組與甲潑尼龍組7天、14天、28天時纖維化程度均較模型組明顯減輕(P<0.05)。見表3。

a：對照組第7天;b：對照組第14天;c：對照組第28天,肺泡間隔和肺泡腔內未見明顯異常；d：模型組第7天;e：模型組第14天;f：模型組第28天;g：環磷酰胺組第7天、h:環磷酰胺組第14天，肺泡萎縮不明顯，間隔略增寬，肺泡上皮略顯腫脹，炎性細胞浸潤減少，成纖維細胞較少；i：環磷酰胺組第28天：部分肺泡結構破壞，局部肺間質有成纖維細胞聚集，形成輕中度肺間質纖維化；j:來氟米特組第7天,均可見肺泡間隔和肺泡腔內有以單核巨噬細胞為主的炎性細胞浸潤，可見成纖維細胞；k:來氟米特組第14天,均可見肺泡萎縮壓扁，肺泡上皮腫脹，炎性細胞浸潤明顯，成纖維細胞較多并可見纖維組織增生；l:來氟米特第28天均可見肺泡間隔炎性細胞減少，但肺泡結構破壞，纖維組織呈條索樣瘢痕改變；m:甲潑尼龍組第7天肺泡間隔和肺泡腔內有炎性細胞浸潤，可見少量成纖維細胞;n:甲潑尼龍組第14天肺泡間隔有炎性細胞浸潤，肺泡上皮略腫脹，成纖維細胞較多；o:甲潑尼龍組第28天肺泡間隔炎性細胞較少，部分肺泡結構破壞，肺間質有成纖維細胞聚集

圖1 小鼠肺病理HE染色結果(×100)

注：兩兩比較為HSD-q檢驗；與對照組比較，aP<0.05;與模型組比較，bP<0.05;與環磷酰胺組比較，cP<0.05;與來氟米特組比較，dP<0.05

a：對照組第7天；b：對照組第14天；c：對照組第28天，肺組織纖維染色未見明顯異常；d：模型組第7天；e：模型組第14天；f：模型組第28天；g：環磷酰胺組第7天，肺間質可見少量藍色的基質膠原纖維；h：環磷酰胺組第14天，肺間質見較多藍色的膠原纖維；i：環磷酰胺組第28天，肺間質膠原增生沉積呈輕度彌漫性；j:來氟米特組第7天；k:來氟米特組第14天，均可見肺間質和肺泡間隔可見藍色膠原沉積；l:來氟米特組第28天，均可見肺間質膠原增生沉積呈彌漫性，并伴有肺泡的融合；m：甲潑尼龍組第7天，僅于血管壁周圍可見少量藍色的基質膠原纖維，余未見明顯異常；n：甲潑尼龍組第14天，肺間質見較多藍色的膠原纖維；o：甲潑尼龍組第28天，肺間質膠原增生明顯，未見肺泡的融合

圖2小鼠肺病理Masson染色結果(×100)

3 討論

目前CTD-ILD的治療目前仍沒有共識，缺乏有效的治療方法，檢索近年國內外的相關文獻報道，所涉及的CTD-ILD 常用的治療藥物有：糖皮質激素、免疫抑制劑、生物制劑等[5-11]。糖皮質激素作為首選藥物被應用于臨床，結果表明激素對肺間質纖維化的療效確是有限的[12-13]。免疫抑制劑中報道較多的有甲氨蝶呤、環磷酰胺、嗎替麥考酚酯等。其中環磷酰胺在CTD-ILD 的治療中療效相對肯定，而來氟米特(LEF)在CTD-ILD的治療報道幾乎未見。環磷酰胺作為一種強有力的經典的免疫抑制劑，主要通過殺傷免疫細胞(T細胞和B細胞)并抑制免疫細胞的數量和功能發揮作用，其起效慢、作用時間持久。來氟米特是丙二腈酰胺類免疫抑制劑，其通過抑制二氫乳酸脫氫酶活性發揮抑制淋巴細胞增殖作用，起效慢、作用時間持久、副作用較其他大多數免疫抑制劑少。本研究對比了環磷酰胺、來氟米特及甲潑尼龍對小鼠肺間質纖維化療效差異。

鑒于博來霉素廣泛用于建立肺纖維化的動物模型，本研究構建了博來霉素誘導的肺纖維化小鼠模型，發現博來霉素誘導后小鼠肺組織炎性細胞浸潤明顯，肺間質和肺泡間隔膠原纖維增生呈彌漫性并伴有肺泡的融合；而使用環磷酰胺或者甲潑尼龍干預后，小鼠在疾病的不同時間炎性細胞浸潤明顯減輕，肺間質和肺泡間隔膠原染色中膠原纖維減少，肺泡炎和肺纖維化病理評分明顯降低。提示環磷酰胺及甲潑尼龍可以抑制炎性細胞的浸潤，降低小鼠肺泡炎和肺纖維化的程度，對肺纖維化小鼠有一定的積極干預作用。但是來氟米特干預組小鼠肺泡炎程度及纖維化程度較模型組差異無統計學意義，提示來氟米特對ILD暫無明確療效。

本實驗結果顯示環磷酰胺和甲潑尼龍能減輕及抑制博來霉素誘導的小鼠的炎性反應和肺間質纖維化的發生發展，而來氟米特對小鼠肺間質纖維化無明顯抑制作用，臨床醫師在使用來氟米特治療CTD-ILD時，需先評估患者的肺部情況，嚴格掌握適應證，謹慎使用LEF，有肺部基礎疾病的患者盡量避免使用。

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Effectsofimmunosuppressiondrugsandprednisoloneonmicemodelofbleomycin-inducedpulmonaryfibrosis

ZhaoLike,MuBinyao,ZhouRongwei,ChengYongjing,HuangCibo

(DepartmentofRheumatology,BeijingHospital,NationalCenterofGerontology,Bejing100730,China)Correspondingauthor:HuangCibo,Email:huangcibo1208@139.com

ObjectiveTo explore the effect of cyclophosphamide(CTX),leflunomide(LEF) and methylprednisolone(MP) on mouse model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis.MethodsA total of 75 C57BL / 6 mice were randomly and evenly divided into control group，model group，CTX group，LEF group and MP group(n=15 in each group).The mice in control group were injected 0.2 mL normal saline from endotracheal ,and others were injected with 0.2mL bleomycin(5 mg/kg) from endotracheal to induce the pulmonary fibrosis model.The next day,the mice in control group and model group were fed with 0.2mL normal saline every day;The mice in other groups were fed with respectively 0.2 mL CTX (50 mg/kg) ,0.2 mL LEF(4 mg/kg)and 0.2 mL MP (10 mg/kg) every day respectively.Finally the mice were sacrificed at day 7,day 14,day 28 separately,and the lung tissue was examined by HE staining and Masson staining to evaluate the degree of alveolitis and fibrosis.Results(1) The body mass of mice in bleomycin-induced groups were decreased compared with control group;(2) The pathological alveolitis scores in CTX group and MP group were significantly decreased compared with mode group at day 7 and day 14(P<0.05),and the pathological fibrosis scores were decreased dramatically compared with mode group at day 7,day 14 and day 28(P<0.05).While there was no statistical significance between LEF group and model group.ConclusionsThe CTX and MP can reduce and inhibit bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis in mices,but not LEF.

Pulmonary fibrosis；Immunosuppressive agents；Hormones；Bleomycin；Cyclophosphamide；Methylprednisolone

R563.13

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.05.027

2017-01-20)

首都醫學發展基金(首發-1-4051)

趙麗珂，主治醫師，Email:likezhao@126.com

黃慈波，主任醫師，碩士生導師，Email:huangcibo1208@139.com