迷走神經電刺激對腦外傷昏迷大鼠意識及前額葉皮質γ-氨基丁酸b1受體表達的影響①

廖誠誠，馮珍，黃菲菲，陳琴

迷走神經電刺激對腦外傷昏迷大鼠意識及前額葉皮質γ-氨基丁酸b1受體表達的影響①

廖誠誠，馮珍，黃菲菲，陳琴

目的 研究迷走神經電刺激(VNS)對腦外傷(TBI)昏迷大鼠的促醒效果及其機制。方法 168只健康Sprague-Dawley大鼠隨機分為空白組、TBI組、拮抗劑組和VNS組，每組42只。空白組不做任何處理，TBI組、VNS組、拮抗劑組撞擊法復制腦外傷模型，造模后昏迷至少30 min的大鼠入選。VNS組予VNS，拮抗劑組側腦室注射Orexin A受體1拮抗劑SB334867后加VNS，TBI組予假VNS。分別于干預后6 h、12 h、24 h觀察大鼠意識水平，應用免疫組化、Western blotting檢測前額葉皮質γ-氨基丁酸b1受體(GABAb1R)表達水平。結果 最終空白組42只、TBI組11只、拮抗劑組13只、VNS組28只大鼠覺醒。Western blotting顯示，干預后12 h、24 h，GABAb1R蛋白表達TBI組＞拮抗劑組＞空白組＞VNS組(F＞60.412,P＜0.001)。免疫組化顯示，GABAb1R蛋白表達TBI組＞拮抗劑組＞VNS組＞空白組(H=15.121,P=0.002)，但不同時間點無顯著性差異(H=3.028,P=0.220)。結論 VNS可促TBI昏迷大鼠覺醒，其促醒機制可能與OrexinA介導大鼠前額葉皮質GABAb1R表達水平下調有關。

腦外傷；昏迷；迷走神經電刺激；促醒；γ-氨基丁酸b1受體；大鼠

腦外傷(traumatic brain injury,TBI)昏迷是世界范圍內的重大健康與社會問題，更對患者本人及家庭造成巨大的經濟負擔[1]。TBI住院患者中，約15%出院時仍處昏迷狀態[2]。

目前，臨床上用于TBI昏迷促醒的神經刺激方法包括經顱直流電刺激、經顱磁刺激、頸部脊髓硬膜外刺激、正中神經電刺激和深部腦刺激等[3-4]，但效果不明顯或副作用大。近年來，迷走神經電刺激(vagus nerve stimulation,VNS)被認為具備促醒潛能[5-6]。

VNS是將電極纏繞在左側頸部迷走神經上，通過脈沖發生器產生電流，刺激迷走神經，直接調節皮層重要區域的功能。VNS被應用于許多神經精神疾病，特別是癲癇；VNS還可用于改善心功能、認知功能，調節情緒等[7]。

γ-氨基丁酸 b1 受體(γ-aminobutyric acid b1 receptor,GABAb1R)與意識抑制狀態密切相關[8-9]，Orexin A則在睡眠-覺醒狀態轉變中發揮關鍵作用[10]。

本研究觀察VNS對TBI昏迷的促醒作用，同時探究前額葉皮質GABAb1R及Orexin A是否參與VNS促醒機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

無特定病源體健康Sprague-Dawley大鼠168只，雌雄不限，體質量250～300 g，由南昌大學動物科學部提供。室溫控制在23℃，自然光照，常規飼養，大鼠自由進食飲水。

大鼠編號001～168，利用隨機數字表分為4組，每組42只。空白組不做任何處理，TBI組造模后予假VNS處理，VNS組造模后予VNS，拮抗劑組造模后側腦室注射Orexin A受體1(Orexin A receptor 1,OXR1)拮抗劑SB334867并予VNS。若實驗過程中大鼠死亡，則選擇新大鼠補充后繼續實驗。

大鼠飼養及實驗遵守本地實驗動物管理委員會相關規定。

1.2 主要儀器及試劑

ZS-BS腦立體定位儀：北京眾實迪創科技發展有限公司。ES-420電刺激儀：日本伊藤超短波株式會社。RM2015切片機：LEICA公司。5804-R低溫高速離心機：EPPENDOF公司。ChemiDocTMMP Bio-Rad凝膠成像系統：北京博雅創新科技發展有限公司。CWB10組織蛋白抽提試劑盒：北京康為世紀生物科技有限公司。抗GABAb1R抗體(ab131417)、免疫組化用兔抗GABAb1R抗體(ab75239)：ABCAM有限公司。抗β-actin單克隆抗體(TA-09)、山羊抗大鼠IgG(ZB-2305)、山羊抗兔IgG(ZB-2301)及相關二抗：北京中杉金橋生物技術有限公司。SB334867：北京華夏遠洋科技有限公司。Pro-light HRP化學發光檢測試劑、化學發光底物：天根生化科技有限公司。

1.3 造模

采用自由落體撞擊法構建TBI動物模型[11]。大鼠置玻璃標本缸內，注入乙醚1～2 ml，1～1.5 min后，大鼠出現軟癱，晃動標本缸大鼠無反應但有呼吸時，立即取出，麻醉成功。頭頂部備皮消毒，切開并分離頭頂部皮膚、骨膜，暴露頂骨；以顱頂冠狀縫與人字縫交點為中點，固定一鐵制圓板。待Sprague-Dawley大鼠恢復后爪疼痛刺激反射時，將直徑10 mm、質量400 g圓柱形金屬撞擊錘從40～44 cm高度沿垂直金屬桿自由下落，撞擊鐵質圓盤上。下落高度依據大鼠體質量整，金屬桿每隔1 cm開口，以減少下落時管內空氣阻力。30 min后根據大鼠的感覺、運動情況[12]，將大鼠意識狀態分6級：Ⅰ級，籠內正常活動；Ⅱ級，籠內活動減少；Ⅲ級，籠內活動減少，能站立但運動失調；Ⅳ級，翻正反射存在但不能站立；Ⅴ級，翻正反射消失，后爪疼痛反射存在；Ⅵ級，疼痛反射消失。大鼠Ⅴ級、Ⅵ級持續至少30 min被認為是昏迷狀態。

1.4 側腦室注射SB334867

拮抗劑組昏迷時間達30 min，即造模成功后，立即側腦室注射。大鼠10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，俯臥位，頭部固定于腦立體定位儀上，頭頂皮膚剃毛消毒。正中切口，長約1 cm。剝離顱骨上附屬組織，清除顱骨表面血跡，暴露前囟，在前囟后1.0 mm、中線旁開1.5 mm，用牙科鉆鉆孔至硬腦膜，消毒針尖刺破硬腦膜，垂直插入約4.5 mm，微量注射器以2.5 μl/min速度注入 SB334867 溶液5 μl(SB334867粉末10 mg/kg溶于60∶40 DMSO中)；留針2 min后拔針。縫合頭皮，消毒后返籠。

1.5 VNS

拮抗劑組側腦室注射完畢，VNS組與拮抗劑組大鼠同時開始VNS。大鼠仰臥位固定，清除頸毛。沿正中線在大鼠喉和胸骨之間開一個長2.5～4 cm切口，將胸骨舌骨肌與胸骨甲狀肌用止血鉗分離并固定；定位頸動脈鞘，固定頸部皮膚和肌肉，止血鉗鈍性分離左側迷走神經3～4 cm。打開電刺激儀，將電極連接到左迷走神經。刺激參數：頻率20 Hz，脈寬0.5 ms，電流1.0 mA，開30 s、關5 min，循環10次，刺激總時間5 min[13]。移除電極，消毒傷口，縫合，放回籠內。

TBI組行相同手術，但無電流輸出。

1.6 觀察指標

VNS結束后6 h、12 h、24 h再次評定大鼠意識狀態，大鼠出現翻正反射定義為覺醒。評定意識狀態后大鼠立即10%水合氯醛過量灌注處死。取前額葉皮質，每組選8只用于Western blotting檢測，6只用于免疫組化檢測。

1.6.1 Western blotting

冰面上分離前額葉皮質組織，蛋白抽屜試劑盒提取蛋白，分裝于小管后置于液氮罐內備用。每個樣本取等量蛋白加入裝載有4×蛋白上樣緩沖液的小管，蛋白質與緩沖液3∶1混合，沸水煮5 min；10%SDS凝膠分離蛋白質，轉移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜上；室溫下用含5%牛奶的TBST溶液(150 mmol/L氯化鈉150 ml、三羥甲基氨基甲烷鹽酸20 ml、0.1%Tween 20 ml，pH=7.4)封閉4 h。加兔抗GABA bR1多克隆抗體(1∶500)、鼠抗?-actin單克隆抗體4℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加相應二抗，室溫1 h。TBST洗膜3次，每次10 min。加化學發光底物浸泡，使用分子成像儀量化條帶蛋白。目的蛋白的灰度與?-actin灰度的比值作為GABAbR1的表達量。

1.6.2 免疫組化

生理鹽水100 ml灌注，4%多聚甲醛300～500 ml灌注至組織變硬。取出大腦，切成1.0×1.0×1.0 cm小塊，4%多聚甲醛固定8 h，石蠟包埋，滑動切片機切成厚40μm薄片。脫蠟，3%H2O2室溫浸泡抗原修復，山羊血清封閉，室溫20 min。滴加兔抗GABAb1R抗體(1∶200)，4℃孵育過夜；PBS漂洗，滴加生物素標記山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h，加辣根酶標記鏈霉卵白素30 min。加顯色劑，蘇木精復染1 min；清水沖洗，中性樹膠封片，通風柜中晾干。400倍顯微鏡下拍照，計算免疫組化(IHC)評分。

評分標準：A代表陽性細胞數分級，0～1%=0、1% ～10%=1、 10% ～50%=2、 50% ～80%=3、 80% ～100%=4；B代表陽性細胞染色強度分級，0=陰性、1=弱陽性、2=陽性、3=強陽性；IHC=A×B[14]。陽性染色表現為棕色或棕褐色的著色膜。

1.7 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理。GABAb1R表達Western blotting結果滿足方差齊性，數據以(xˉ±s)表示，行單因素方差分析；IHC評分以秩值表示，采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 意識狀態

空白組42只覺醒，TBI組大鼠11只覺醒，拮抗劑組13只覺醒，VNS組28只覺醒。

2.2 Western blotting

VNS后6 h，前額葉皮質GABAb1R表達水平拮抗劑組＞TBI組＞VNS組＞空白組，各TBI組與空白組相比有顯著性差異(P＜0.05)；VNS后12 h和24 h，TBI組＞拮抗劑組＞空白組＞VNS組，各組與TBI組相比有顯著性差異(P＜0.05)，拮抗劑組與VNS組相比有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

表1 Western blotting各組不同時間點GABAb1R的表達(相對表達量)

2.3 免疫組化

前額葉皮質GABAb1R分布于細胞膜和細胞間隙(圖1)，各組間GABAb1R表達比較有非常顯著性差異(P＜0.01)。見表2。但不同時間點間無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

表2 各組前額葉皮質GABAb1R表達

表3 不同時間點前額葉皮質GABAb1R表達

圖1 前額葉皮質GABAb1R在不同組別和時間點的表達(免疫組化染色，400×)

3 討論

迷走神經是混合型神經纖維，在中樞廣泛投射，其傳入纖維通過孤束核及其上行網狀結構系統，到達下丘腦、杏仁核、海馬，并彌散性投射至大腦皮質。該解剖特點可能是其治療各類神經系統疾病的結構基礎。

1997年，美國食品藥品監督管理局批準VNS應用于治療癲癇，2005年批準用于治療抑郁。目前VNS也應用于治療其他神經系統疾病，如焦慮、偏頭痛、帕金森病和阿爾茨海默病[15-17]。Kumaria等[5]提出，VNS也可用于治療TBI；動物實驗證實VNS可改善TBI預后，增加大鼠認知及運動功能[18-20]。VNS對TBI動物可表現出抗水腫[21]、保護神經元、減少血腦屏障破壞[22]的效應，還可降低炎癥壞死因子及增加腦血流[6,23]。在VNS在改善TBI后意識水平方面，僅有個別報道[6]。

本研究用動物實驗探討VNS對TBI昏迷的促醒作用及相關機制。電刺激參數參考Shi等[6]的參數；Smith等也用相同的VNS參數治療TBI[24]。

研究發現，VNS有促醒效果，與董曉陽等[25]實驗結果一致。VNS的促醒機理可能在于迷走神經在中樞神經系統投射廣泛，包括控制覺醒的重要區域，如小腦、中縫背核、臂旁核、下丘腦、網狀系統等[26-27]，VNS通過激活這些區域促進昏迷大鼠覺醒；同時，VNS具有抗炎抗水腫作用[5]，有利于大腦結構功能恢復，促進覺醒。

本研究發現，TBI后大鼠前額葉皮質GABAb1R表達上調，VNS干預后該GABAb1R下調，VNS的促醒作用可能與下調前額葉皮質GABAb1R表達有關。GABAbR廣泛分布于哺乳動物中樞經系統[28]，參與癲癇、焦慮、抑郁、傷害感、成癮及睡眠等病理或生理過程[29-30]；GABAbR還參與維持睡眠狀態[8-9]。VNS下調這一抑制性遞質受體，使中樞趨于活躍，有利于消除TBI后皮層抑制，促進覺醒。

我們前期研究發現，VNS的促醒與上調大鼠前額葉Orexin A有關。本研究顯示，當大鼠Orexin A被阻斷后，VNS下調GABAb1R作用減弱。Orexin A是下丘腦外側區生成的小分子神經肽，屬興奮性遞質，它對其他興奮性神經元，如單胺能及膽堿能神經元存在投射，可調節其他神經遞質分泌。Orexin A在TBI昏迷促醒中可能起“開關”作用，介導VNS下調GABAb1R，從而促醒。

VNS前需在頸部分離出迷走神經，此過程引起大鼠呼吸道分泌物增多、呼吸不暢甚至窒息。后期將探索無創VNS的可能。本研究僅探討了VNS對TBI昏迷大鼠前額葉皮質GABAb1R表達的影響，尚未涉及其他興奮性遞質表達。后期將進一步探索VNS促醒機制。

綜上所述，VNS可促TBI后昏迷的覺醒，其機制可能與Orexin A介導下調大鼠前額葉皮質GABAb1R表達有關。其具體的作用機制尚有待于進一步研究。

[1]Maas AI,Stocchetti N,Bullock R.Moderate and severe traumatic brain injury in adults[J].Lancet Neurol,2008,7(8):728-741.

[2]Andriessen TM,Horn J,Franschman G,et al.Epidemiology,severity classification,and outcome of moderate and severe traumatic brain injury:a prospective multicenter study[J].J Neurotrauma,2011,28(10):2019-2031.

[3]Georgio Poulos M,Katsakiori P,Kefalopoulou Z,et al.Vegetative state and minimally conscious state:a review of the therapeutic interventions[J].Stereotact Funct Neurosurg,2010,88(4):199-207.

[4]Neren D,Johnson MD,Legon W,et al.Vagus nerve stimulation and other neuromodulation methods for treatment of traumatic brain injury[J].Neurocrit Care,2016,24(2):308-319.

[5]Kumaria A,Tolias CM.Is there a role for vagus nerve stimulation therapy as a treatment of traumatic brain injury?[J].Br J Neurosurg,2012,26(3):316-320.

[6]Shi C,Flanagan SR,Samadani U.Vagus nerve stimulation to augment recovery from severe traumatic brain injury impeding consciousness:a prospective pilot clinical trial[J].Neurol Res,2013,35(3):263-276.

[7]宋璐,劉愛華.迷走神經刺激術在非癲癇領域的應用進展[J].中華臨床醫師雜志(電子版),2012,6(17):5191-5194.

[8]Gmeiner F,Ko?odziejczyk A,Yoshii T,et al.GABA(B)receptors play an essential role in maintaining sleep during the second half of the night in Drosophila melanogaster[J].J Exp Biol,2013,216(Pt 20):3837-3843.

[9]Vienne J,Bettler B,Franken P,et al.Differential effects of GABAB receptor subtypes,{gamma}-hydroxybutyric acid,and Baclofen on EEG activity and sleep regulation[J].J Neurosci,2010,30(42):14194-14204.

[10]de Lecea L,Huerta R.Hypocretin(orexin)regulation of sleep-to-wake transitions[J].Front Pharmacol,2014,5:16.

[11]Feng Z,Zhong YJ,Wang L,et al.Resuscitation therapy for traumatic brain injury-induced coma in rats:mechanisms of median nerve electrical stimulation[J].Neural Regen Res,2015,10(4):594-598.

[12]Feng Z,Du Q.Mechanisms responsible for the effect of median nerve electrical stimulation on traumatic brain injury induced coma:orexin-A-mediated N-methyl-Daspartate receptor subunit NR1 upregulation[J].Neural Regen Res,2016,11(6):951-956.

[13]Jiang Y,Li L,Liu B,et al.PPARγ upregulation induced by vagus nerve stimulation exerts anti-inflammatory effect in cerebral ischemia/reperfusion rats[J].Med Sci Monit,2015,21:268-275.

[14]陶玉,尹海兵,陳旭東,等.UBE2C基因在食管鱗癌中的表達及其臨床意義[J].江蘇醫藥,2016,42(16):1816-1818.

[15]Zhou L,Lin J,Kui G,et al.Neuroprotective effects of vagus nerve stimulation on traumatic brain injury[J].Neural Regen Res,2014,9(17):1585-1591.

[16]Groves DA,Brown VJ.Vagal nerve stimulation:a review of its applications and potential mechanisms that mediate its clinical effects[J].Neurosci Biobehav Rev,2005,29(3):493-500.

[17]Vonck K,Raedt R,Naulaerts J,et al.Vagus nerve stimulation…25 years later!What do we know about the effects on cognition?[J].Neurosci Biobehav Rev,2014,45:63-71.

[18]Hays SA.Enhancing rehabilitative therapies with vagus nerve stimulation[J].Neurotherapeutics,2016,13(2):382-394.

[19]Smith DC,Tan AA,Duke A,et al.Recovery of function after vagus nerve stimulation initiated 24 hours after fluid percussion brain injury[J].J Neurotrauma,2006,23(10):1549-1560.

[20]Pruitt DT,Schmid AN,Kim LJ,et al.Vagus nerve stimulation delivered with motor training enhances recovery of function after traumatic brain injury[J].J Neurotrauma,2016,33(9):871-879.

[21]Clough RW,Neese SL,Sherill LK,et al.Cortical edema in moderate fluid percussion brain injury is attenuated by vagus nerve stimulation[J].Neuroscience,2007,147(2):286-293.

[22]Lopez NE,Krzyzaniak MJ,Costantini TW,et al.Vagal nerve stimulation decreases blood-brain barrier disruption after traumatic brain injury[J].J Trauma Acute Care Surg,2012,72(6):1562-1566.

[23]Bansal V,Ryu SY,Lopez N.Vagal stimulation modulates inflammation through a ghrelin mediated mechanism in traumatic brain injury[J].Inflammation,2012,35(1):214-220.

[24]Labiner DM,Ahern GL.Vagus nerve stimulation therapy in depression and epilepsy:therapeutic parameter settings[J].Acta Neurol Scand,2007,115(1):23-33.

[25]董曉陽,馮珍.迷走神經電刺激對腦外傷昏迷大鼠前額葉皮質5-羥色胺2A受體表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2016,22(4):404-408.

[26]Ansari S,Chaudhri K,AlMoutaery KA.Vagus nerve stimulation:indications and limitations[J].Acta Neurochir Suppl,2007,97(2):281-286.

[27]Ruffoli R,Giorgi FS,Pizzanelli C,et al.The chemical neuroanatomy of vagus nerve stimulation[J].J Chem Neuroanat,2011,42(4):288-296.

[28]Benke D,Zemoura K,Maier PJ.Modulation of cell surface GABAB receptors by desensitization,trafficking and regulated degradation[J].World J Biol Chem,2012,3(4):61-72.

[29]袁蓮芳,陳果,侯麗,等.γ-氨基丁酸B受體與應激性防御反應研究現狀[J].中華實用診斷與治療雜志,2015,29(6):521-523.

[30]Black SW,Morairty SR,Chen TM,et al.GABAB agonism promotes sleep and reduces cataplexy in murine narcolepsy[J].J Neurosci,2014,34(19):6485-6494.

Effect of Vagus Nerve Stimulation on Wake-promoting and Expression of γ-aminobutyric Acid b1 Receptor in Prefrontal Cortex of Coma Rats post Traumatic Brain Injury

LIAO Cheng-cheng,FENG Zhen,HUANG Fei-fei,CHEN Qin
Department of Rehabilitation Medicine,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang,Jiangxi 330006,China

FENG Zhen.E-mail:fengzhenly@sina.com

Objective To investigate the wake-promoting effect of vagus nerve stimulation(VNS)on coma rats after traumatic brain injury(TBI),and the related mechanism.Methods A total of 168 healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank group,TBI group,antagonist group and VNS group,42 rats in each group.The latter three groups were established TBI model with impact,and the rats in coma at least 30 minutes were included.VNS group accepted VNS,the antagonist group were injected intralateroventricularly Orexin A receptor 1(OXR1)antagonist SB334867,and TBI group accepted sham VNS.Their behaviors were observed to determine the level of consciousness six,twelve and 24 hours after intervention,while the expression of γ-aminobutyric acid b1 receptor(GABAb1R)in prefrontal cortex was detected with immunohistochemistry and Western blotting.Results There were 42 rats in the blank group,11 rats in TBI group,13 rats in the antagonist group,and 28 rats in VNS group awakened finally.The expression of GABAb1R in prefrontal cortex ranged as TBI group,antagonist group,blank group and VNS group from more to less twelve and 24 hours after intervention under Western blotting(F＞60.412,P＜0.001),and it ranged as TBI group,antagonist group,VNS group and blank group under immunohistochemistry(H=15.121,P=0.002),with no significant difference among time points(H=3.028,P=0.220).Conclusion VNS can promote waking from coma in rats after TBI,which may relate with the decrease of GABAb1R in prefrontal cortex that induced by OrexinA.

traumatic brain injury;coma;vagus nerve stimulation;wake-promoting;γ-aminobutyric acid b1 receptor;rats

R651.1

A

1006-9771(2017)09-1037-06

2016-11-05

2017-05-11)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.09.010

[本文著錄格式] 廖誠誠，馮珍，黃菲菲，等.迷走神經電刺激對腦外傷昏迷大鼠意識及前額葉皮質γ-氨基丁酸b1受體表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23(9):1037-1042.

CITED AS:Liao CC,Feng Z,Huang FF,et al.Effect of vagus nerve stimulation on wake-promoting and expression of γ-aminobutyric acid b1 receptor in prefrontal cortex of coma rats post traumatic brain injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(9):1037-1042.

國家自然科學基金項目(No.81260295)。

南昌大學第一附屬醫院康復醫學科，江西南昌市330006。作者簡介：廖誠誠(1988-)，女，漢族，江西贛州市人，碩士研究生，主要研究方向：神經康復。通訊作者：馮珍，女，江西南昌市人，教授，主任醫師，主要研究方向：神經康復。E-mail:fengzhenly@sina.com。