磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白在帕金森病模型大鼠黑質(zhì)區(qū)的表達①

胡馨月，劉斌，徐佳莉，張晉霞

磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白在帕金森病模型大鼠黑質(zhì)區(qū)的表達①

胡馨月，劉斌，徐佳莉，張晉霞

目的 觀察磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路相關(guān)蛋白在帕金森病模型大鼠黑質(zhì)區(qū)的表達及變化情況。方法 96只健康Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、PI3K抑制劑LY294002組及p-mTOR抑制劑雷帕霉素組，每組又分為模型制備成功后4 d和8 d兩個亞組，每個亞組12只。后三組頸背部皮下注射魚藤酮制作帕金森病大鼠模型，相應(yīng)時間點免疫組化及Western blotting檢測大鼠黑質(zhì)區(qū)PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組各時間點PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達增加(P＜0.05)，8 d亞組高于4 d亞組(P＜0.05)。與模型組比較，LY294002組各時間點p-Akt、p-mTOR蛋白表達減少(P＜0.05)，PI3K蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)；雷帕霉素組各時間點p-mTOR蛋白表達下降(P＜0.05)，PI3K、p-Akt蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)。結(jié)論 黑質(zhì)PI3K/Akt/mTOR信號通路激活可能是帕金森病發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一。

帕金森病；磷脂酰肌醇3激酶；蛋白激酶B；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；黑質(zhì)；大鼠

帕金森病是好發(fā)于中老年人的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，發(fā)病率逐年增加，主要病理改變是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性和缺失[1]，病因及確切的發(fā)病機制尚未明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，帕金森病與細胞自噬關(guān)系密切[2-6]。

磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,又稱Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的重要信號通路，在自噬中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[7]。PI3K是一種存在于細胞質(zhì)的復(fù)合體，在多種生長因子刺激下可被激活，是信號通路的重要組成分子。Akt是由480個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，是PI3K下游蛋白的關(guān)鍵分子，在該信號傳導(dǎo)通路中起關(guān)鍵作用。mTOR是一種含有2549個氨基酸殘基的蛋白分子，為Akt下游底物。p-Akt和p-mTOR是Akt及mTOR的活化形式。本研究檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白PI3K、p-Akt和p-mTOR在帕金森病模型大鼠黑質(zhì)區(qū)的表達，探討其在帕金森病發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性Sprague-Dawley大鼠96只，體質(zhì)量250～300 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，合格證號SCXK-(軍)2014-0001。在華北理工大學(xué)屏障環(huán)境動物實驗室自由喂養(yǎng)，室溫(23±2)℃，自然光照，適應(yīng)喂養(yǎng)2周。

將大鼠編號，用隨機數(shù)生成器隨機抽取不同數(shù)字，將大鼠隨機分為假手術(shù)組、帕金森病模型組(模型組)、PI3K抑制劑2-(4-嗎啉基)-8-苯基-4氫1苯并吡喃-4-酮(LY294002)組及mTOR抑制劑雷帕霉素組，每組又分為模型制備成功后4 d和8 d兩個亞組，每個亞組12只。

1.2 主要試劑及儀器

魚藤酮、葵花油：北京博奧森生物工程有限公司。PI3K、p-Akt及p-mTOR兔抗鼠多克隆抗體：ARIGO公司。免疫組化檢測試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。EG1150 H型組織包埋機：LEICA公司。BX53全自動顯微鏡掃描系統(tǒng)：OLYMPUS公司。

1.3 側(cè)腦室注射

LY294002組10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，將鼠頭固定于立體定向儀上，切開頭皮，分離皮下組織，10%H2O2擦試顱骨，充分暴露前囟“十”字交叉骨性結(jié)構(gòu)。在前囟點旁開0.9 mm，向后1.5 mm，用微型牙科鉆打孔，有明顯穿透感后拔出，到達硬腦膜表面。微量進樣器抽吸10 mmol/L LY294002溶液10μl，沿鉆孔緩慢進針，深3.8 mm，在5 min內(nèi)勻速緩慢注完，留針5 min后緩慢拔針。

雷帕霉素組同法注射8 ng/μl雷帕霉素4μl。

模型組和假手術(shù)組同法注射等體積生理鹽水。

1.4 模型制備

側(cè)腦室注射后，采用頸背部皮下注射魚藤酮制備帕金森病大鼠模型[8]。魚藤酮以葵花油配制成2 mg/ml乳液，充分震蕩混勻后避光保存。模型組、LY294002組及雷帕霉素組大鼠稱體質(zhì)量后，每只大鼠每天予魚藤酮2 mg/kg頸背部皮下注射；假手術(shù)組每天頸背部皮下注射等量葵花油，直至出現(xiàn)行為學(xué)改變造模成功[9]后停止注射。選擇評分2～6分者為實驗大鼠。

術(shù)中大鼠肛溫維持36.5～37.5℃。術(shù)后連續(xù)腹腔注射慶大霉素1萬U/kg，共3 d，預(yù)防感染。

1.5 免疫組化染色

造模成功后4 d和8 d，各組分別取6只大鼠，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。劍突下橫切口約2～3 cm，向上剪斷3根肋骨，暴露心臟；剪開右心耳，經(jīng)心臟灌注4℃生理鹽水100～200 ml至肝臟完全變白，灌注4%多聚甲醛150～200 ml，至大鼠肝臟變硬、肢體僵直。迅速斷頭取腦組織，4%多聚甲醛中固定過夜。按《大鼠腦立體定位圖譜》[10]取大鼠黑質(zhì)區(qū)，常規(guī)脫水，石蠟包埋。連續(xù)切片，厚4 μm，撈片后60℃烤箱烘干2.5 h。

切片脫蠟至水，3%H2O2常溫孵育10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶。加0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)，微波煮沸10 min，冷卻至室溫。羊血清封閉，室溫孵育10 min。加入PI3K(1∶300)、p-Akt(1∶400)、p-mTOR(1∶200)一抗，4℃冰箱過夜；加入生物素化二抗，37℃孵育30 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素溶液，室溫孵育15 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染。常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。光鏡下，以細胞質(zhì)或核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒樣物質(zhì)為陽性。高倍鏡下觀察各組大鼠黑質(zhì)區(qū)不重疊的6個視野，行PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白陽性細胞計數(shù)，取平均值。

1.6 Western blotting

各級其余6只大鼠，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。斷頭后于冰上開顱取腦，冷PBS漂洗殘余血，立即分離出新鮮紋狀體，將蛋白酶抑制劑PMSF 4μl加入冷RIPA組織裂解液1 ml中，混勻，冰上備用。取腦組織標(biāo)本加入含PMSF的裂解液中，體積比1∶3混合，勻漿器充分勻漿，冰上裂解40 min；4℃、12,000 r/min離心15 min。取上清，轉(zhuǎn)移到另一離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取蛋白樣品每個泳道50μg，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸銨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離后，半干轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上，轉(zhuǎn)移緩沖液甘氨酸5.8 g、Tris 2.9 g、SDS 0.37 g，重蒸餾水800 ml溶解后加入甲醇200 ml。PVDF膜封閉液中封閉，加入PI3K、p-Akt、p-mTOR一抗(1∶1000)4℃孵育過夜。PBS洗膜，加入羊抗兔二抗(1∶2000)，37℃ 1 h；洗膜。ECL顯色，膠片曝光顯影。采用Image J軟件分析目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白β-action的相對光密度(OD)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化

與假手術(shù)組比較，模型組各時間點PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達增加(P＜0.05)，8 d組高于4 d組(P＜0.05)。與模型組比較，LY294002組各時間點p-Akt、p-mTOR蛋白表達減少(P＜0.05)，PI3K蛋白表達無顯著性差異(P＞0.05)；雷帕霉素組各時間點p-mTOR蛋白表達下降(P＜0.05)，PI3K、p-Akt蛋白表達無顯著性差異(P＞0.05)。見表1～表3，圖1～圖3。

2.2 Western blotting

與假手術(shù)組比較，模型組各時間點PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達增加(P＜0.05)，8 d組高于4 d組(P＜0.05)。與模型組比較，LY294002組各時間點p-Akt、p-mTOR蛋白表達減少(P＜0.05)，PI3K蛋白表達無顯著性差異(P＞0.05)；雷帕霉素組各時間點p-mTOR蛋白表達下降(P＜0.05)，PI3K、p-Akt蛋白表達無顯著性差異(P＞0.05)。見表4～表6，圖4。

表1 各組造模后4 d、8 d免疫組化PI3K表達(/高倍視野)

表2 各組造模后4 d、8 d免疫組化p-Akt表達(/高倍視野)

表3 各組造模后4 d、8 d免疫組化p-mTOR表達(/高倍視野)

表4 各組造模后4 d、8 d Western blotting PI3K表達(OD)

圖1 各組各時間點PI3K表達(免疫組化染色，bar=20 μm)

圖2 各組各時間點p-Akt表達(免疫組化染色，bar=20 μm)

圖3 各組各時間點p-mTOR表達(免疫組化染色，bar=20 μm)

圖4 各組各時間點PI3K、p-Akt和p-mTOR表達(Western blotting)

表5 各組造模后4 d、8 d Western blotting p-Akt表達(OD)

表6 各組造模后4 d、8 d Western blotting p-mTOR表達(OD)

3 討論

帕金森病的病因及確切的發(fā)病機制尚未明確，可能與年齡、遺傳、環(huán)境、細胞凋亡、自噬、氧化應(yīng)激、線粒體功能衰竭、鈣超載、興奮性氨基酸毒性等有關(guān)[1,11-13]。自噬在帕金森病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[2-6]。自噬受多種信號通路的調(diào)控，PI3K/Akt/mTOR信號通路是其中重要信號調(diào)控通路[14]。

PI3K是真核生物細胞膜的組成部分，可以磷酸化肌醇磷脂肌醇環(huán)上的3'-OH，其家族包括許多脂質(zhì)激酶；激活的PI3K可促進細胞存活，抑制凋亡[15]。Akt作為PI3K的主要底物之一，參與神經(jīng)細胞的遷移、存活等過程，并對神經(jīng)元大小具有調(diào)節(jié)作用。mTOR廣泛存在于細胞質(zhì)內(nèi)，主要依據(jù)細胞營養(yǎng)狀態(tài)調(diào)節(jié)信號，控制下游與翻譯、轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的多種蛋白的磷酸化，在細胞生存、生長和增殖中起調(diào)控作用。Akt是PI3K下游直接靶點蛋白，受上游PI3K的激活、磷酸化；活化的Akt可以直接激活mTOR，進而作用于下游靶蛋白，調(diào)控mRNA翻譯效率，從而增加一系列與細胞生長、分化相關(guān)的蛋白表達[7,16-17]。

PI3K/Akt/mTOR信號通路在神經(jīng)元的發(fā)育、生存和功能方面十分重要，多種基因/蛋白參與帕金森病的發(fā)病，直接影響中腦黑質(zhì)多巴胺含量[18-19]。該信號通路也參與細胞自噬和分解異常蛋白，在對抗神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮重要作用[20]。本研究顯示，帕金森病模型大鼠黑質(zhì)區(qū)高表達PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白，提示PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白在帕金森病發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。這與Khwanraj等[21]的研究結(jié)果基本一致。

LY294002是一種人工合成的PI3K特異性抑制劑，可靶向抑制PI3K催化P110亞基的活化，從而抑制下游底物[22]。雷帕霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，靶向抑制mTOR活性，調(diào)節(jié)線粒體功能，延長時序壽命，減少神經(jīng)元凋亡[23-24]。趙明明等[25]在神經(jīng)元機械性損傷中，Western blotting發(fā)現(xiàn)造模后3 h Akt達高峰，應(yīng)用LY294002干預(yù)后Akt明顯降低。Malagelada等[26]報道，雷帕霉素可以減少6-羥多巴對PC12細胞的毒性，并增加1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導(dǎo)的帕金森病小鼠黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元存活。本研究顯示，應(yīng)用LY294002及雷帕霉素特異性抑制劑阻斷該通路后，帕金森病模型大鼠黑質(zhì)區(qū)相應(yīng)時間點p-Akt和p-mTOR蛋白陽性表達減少。

綜上所述，PI3K/Akt/mTOR信號通路在帕金森病中過度表達，可能在帕金森病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。使用此通路的抑制劑可能會對控制帕金森病的進展產(chǎn)生積極影響，可能為帕金森病的治療提供新的干預(yù)靶點。

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Expression of Phosphatidylinositol 3-Kinase,Protein Kinase B and Mammalian Target of Rapamycin in Substantia Nigra in Rats with Parkinson's Disease

HU Xin-yue,LIU Bin,XU Jia-li,ZHANG Jin-xia
First Department of Neurology,the Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China

LIU Bin.E-mail:liubintsh@126.com

Objective To observe the expression of phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)/protein kinase B(Akt)/mammalian target of rapamycin(mTOR)signaling pathway in substantia nigra in rats with Parkinson's disease(PD).Methods A total of 96 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group,model group,PI3K inhibitor LY294002 group and mTOR inhibitor rapamycin group.Each group was divided into 4 days and 8 days subgroups after the model.PD model was established by injecting rotenone subcutaneously.The expression of PI3K,p-Akt and p-mTOR in substantia nigra was detected with immunohistochemistry and Western blotting.Results Compared with the sham group,the expression of PI3K,p-Akt and p-mTOR increased in the model group(P＜0.05),and was more in 8 days subgroup than in 4 days subgroup(P＜0.05).Compared with the model group,the expression of p-Akt and p-mTOR reduced in the LY294002 group(P＜0.05),while the expression of PI3K varied little(P＞0.05);the expression of p-mTOR decreased in the rapamycin group(P＜0.05),while the expression of PI3K and p-Akt varied little(P＞0.05).Conclusion PI3K/Akt/mTOR signaling pathway is over activated in substantia nigra in rats with Parkinson's disease,which may play an important role in occurrence and development of the disease.

Parkinson's disease;phosphatidylinositol 3-kinase;protein kinase B;mammalian target of rapamycin;substantia nigra;rats

R742.5

A

1006-9771(2017)09-1043-08

2017-01-10

2017-04-01)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.09.011

[本文著錄格式] 胡馨月，劉斌，徐佳莉，等.磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白在帕金森病模型大鼠黑質(zhì)區(qū)的表達[J].中國康復(fù)理論與實踐,2017,23(9):1043-1050.

CITED AS:Hu XY,Liu B,Xu JL,et al.Expression of phosphatidylinositol 3-kinase,protein kinase B and mammalian target of rapamycin in substantia nigra in rats with Parkinson's disease[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(9):1043-1050.

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(No.20130064)。

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河北唐山市063000。作者簡介：胡馨月(1989-)，女，漢族，河北承德市人，碩士研究生，醫(yī)師，主要研究方向：帕金森病及相關(guān)疾病。通訊作者：劉斌，男，碩士，主任醫(yī)師，教授，研究生導(dǎo)師。E-mail:liubintsh@126.com。