體外培養大鼠星形膠質細胞水通道蛋白4的表達①

徐立新，董麗萍，師忠芳，閆旭，楊少華，袁芳

體外培養大鼠星形膠質細胞水通道蛋白4的表達①

徐立新1,2，董麗萍1,2，師忠芳1,2，閆旭1,2，楊少華3，袁芳1,2

目的 研究水通道蛋白4(AQP4)在體外培養大鼠星形膠質細胞中的表達規律。方法 取新生1 d Wistar大鼠大腦皮層行星形膠質細胞原代培養，分別于原代培養3 d、5 d、7 d、9 d及傳代培養9 d行膠質纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光染色；實時熒光定量聚合酶鏈反應及AQP4免疫熒光染色檢測AQP4 mRNA及蛋白的表達。結果 原代及傳代培養不同時間點95%以上細胞GFAP免疫熒光染色陽性，且GFAP表達量逐漸增加。原代培養3 d有AQP4 mRNA表達，3 d和5 d AQP4 mRNA表達水平無顯著性差異(P＞0.05)，7 d AQP4 mRNA表達升高(P＜0.05)，9 d持續升高(P＜0.05)；傳代培養9 d與原代培養9 d AQP4 mRNA表達無顯著性差異(P＞0.05)。AQP4蛋白表達與AQP4 mRNA表達一致。結論 大鼠星形膠質細胞原代培養3 d即有AQP4表達，之后逐漸增加，9 d左右表達漸趨穩定。

水通道蛋白4；星形膠質細胞；細胞培養；大鼠

水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是近年來發現的位于細胞膜上與水的通透性相關的轉運蛋白，其中AQP4是腦內最重要的AQPs，在腦組織中分布最廣，含量最多，主要參與鉀離子緩沖、體液自身調節、中樞滲透壓調節等[1-2]，特別與癲癇、腦缺血、腦外傷、腦腫瘤等所致的腦水腫密切相關[3-4]。研究發現，AQP4高表達于星形膠質細胞和室管膜細胞，尤其是與毛細血管和軟腦膜接觸的星形膠質細胞膜處[5]。Yamamoto等[6]利用體外培養神經細胞研究發現，AQP4只在星形膠質細胞表達。本研究觀察體外培養條件下大鼠星形膠質細胞AQP4表達的時程規律，為進一步研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

最低必需培養基(minimum essential medium,MEM)、 胎 牛 血 清 (fetal bovine serum,FBS)： GIBCO公司。兔抗大鼠膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗體：DAKO公司。AQP4多克隆抗體：ABCAM公司。Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG二抗：MOLECULAR PROBES公司。TRIzol試劑：LIFE TECHNOLOGIES公司。逆轉錄試劑盒：PROMEGA公司。SYBR GreenⅠ核酸染料試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)儀(LightCycler480)：ROCHE公司。倒置相差顯微鏡(Axio ObserverA1)：ZEISS公司。

1.2 實驗動物

新生1 d Wistar大鼠，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供，合格證號SCSK(京)2005-0013。實驗過程按實驗動物使用3R原則給予人道關懷，并通過北京市神經外科研究所動物福利倫理審查(No.201401007)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

參考McCarthy的方法[7]并加以改良[8]行大鼠星形膠質細胞原代培養。無菌條件下，取新生1 d Wistar大鼠大腦皮層組織，用含10%胎牛血清的MEM分散成單細胞懸液后，接種于底面積75 cm2培養瓶中，5%CO2培養箱內37℃培養。每2～3天觀察、半量換液1次。原代培養9 d的星形膠質細胞行傳代培養，GFAP免疫熒光染色鑒定培養細胞純度。

1.3.2 GFAP及AQP4免疫熒光染色

根據我們前期研究的方法進行實驗[9]。培養細胞丙酮固定30 min，正常羊血清封閉15 min，加入兔抗大鼠GFAP抗體(1∶50)或兔抗大鼠AQP4抗體(1∶100)，陰性對照用PBS代替一抗，4℃過夜。Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(1∶100)避光孵育3 h。含DAPI的熒光封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

根據我們前期研究的方法[10]，應用Image J圖像分析軟件對GFAP及AQP4免疫熒光結果進行圖像分析。一個時間點取3張玻片，高倍鏡下(200×)隨機選取3個視野，將圖片黑白反向處理，計算9個視野中平均光密度值(average optical density,AOD)。

1.3.3 逆轉錄qRT-PCR

方法進行實驗[11]。分別于原代培養3 d、5 d、7 d、9 d及傳代培養9 d使用TRIzol試劑提取培養細胞總RNA，應用逆轉錄試劑盒合成cDNA，用SYBY Green方法行PCR。根據GenBank大鼠AQP4(NM012825.4)序列、β-actin(NM031144.3)序列進行引物設計：

AQP4上游5'-TGA ATC CAG CTC GAT CCT TTG-3'，下游5'-TAT CCA GTG GTT TTC CCA GTT TC-3'；

β-actin上游 5'-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CC-3'，下游5'-CTA GGA GCC AGA GCA GTA ATC-3'。

由深圳華大基因科技服務有限公司合成。

PCR反應體系包括AQP4或β-actin上游引物和下游引物各 1 μl，SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，模板cDNA 1 μl，DEPC水7 μl。PCR反應條件：95 ℃預熱10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。

用LightCycler480 Software 1.5軟件進行分析，用AQP4/β-actin表示AQP4 mRNA表達水平。每個時間點取3個樣品，重復3次。

1.4 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。各組數據以(xˉ±s)表示，進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用SNK-q檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 培養細胞鑒定

培養不同時間細胞均呈大致均一的單層扁平細胞，具有短而粗大的細胞突起，并且隨培養時間延長，細胞密度逐漸增加(圖1)。培養細胞95%以上為GFAP染色陽性(圖2)。隨培養時間延長，GFAP表達增加。見表1。

2.2 AQP4 mRNA

原代培養3 d可檢測到AQP4 mRNA表達；3 d、5 d AQP4 mRNA表達無顯著性改變(P＞0.05)；7 d AQP4 mRNA表達升高(P＜0.05)，9 d持續升高(P＜0.05)；傳代培養9 d與原代培養9 d AQP4 mRNA表達無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。AQP4免疫熒光定量結果與AQP4 mRNA表達變化一致。見圖3、表1。

圖1 培養大鼠細胞形態(倒置相差顯微鏡PlasDIC模式,bar=200 μm)

圖2 培養大鼠細胞GFAP表達(免疫熒光染色,bar=200 μm)

圖3 培養大鼠細胞AQP4表達(免疫熒光染色,bar=200 μm)

表1 培養大鼠細胞各時間點GFAP、AQP4 mRNA和AQP4表達

3 討論

腦水腫是各種腦疾病常見并發癥，其發生與多種因素有關[12]，實質是腦內水平衡紊亂。研究顯示，腦水腫主要是星形膠質細胞腫脹[13]。

星形膠質細胞是中樞神經系統內數量最多的一類細胞，在神經元的損傷修復、信號傳遞、突觸形成等方面具有重要作用[14-15]。近年來對星形膠質細胞在各種腦疾病中作用的研究越來越多，尤其是腦損傷后星形膠質細胞在腦水腫中所發揮的作用受到研究者關注。

AQP4是腦內最重要的AQPs，主要表達于星形膠質細胞質膜，在各種腦疾病所致腦水腫中起重要作用[16]，其表達受諸多因素調節[17-18]。大量實驗表明，AQP4的功能是雙向的，既可能是腦水腫發生的促進因素，也可能是腦水腫消散的促進因素[19]。如何通過干預腦內AQP4表達治療腦水腫，已成為開發腦水腫治療新方法的關鍵[20]。

在體實驗研究不能排除損傷過程中各種復雜因素的影響，也不能區分細胞的原發損傷和繼發損傷，使觀察單因素對細胞的影響受到限制。利用星形膠質細胞體外培養進行AQP4表達研究越來越受到重視。但由于目前為止尚沒有關于星形膠質細胞體外培養下AQP4表達規律的報道，使用培養多久的星形膠質細胞進行相關研究成為困擾研究者的難題。

鑒于原代培養3 d星形膠質細胞才開始貼壁生長，故本實驗從細胞培養3 d開始觀察，通過GFAP免疫熒光染色鑒定培養細胞純度。GFAP是構成中間纖維的主要成分，在成熟星形膠質細胞中表達，被公認為星形膠質細胞的特征性標志物[21]。GFAP也可作為觀察星形膠質細胞增生的指標[22-23]。本研究中，我們觀察到原代及傳代培養不同時間點，95%以上培養細胞GFAP免疫熒光染色陽性，且表達量隨培養時間延長逐漸增加，但原代培養9 d和傳代培養9 d無顯著性差異，提示這時星形膠質細胞增殖處于相對穩定狀態。

倒置相差顯微鏡觀察，原代培養3 d、5 d時，培養瓶中星形膠質細胞數量少，7 d時細胞數量增多，原代培養9 d與傳代培養9 d后，培養瓶中星形膠質細胞匯合程度均達90%以上。

AQP4免疫熒光和qRT-PCR顯示，原代培養3 d星形膠質細胞就有微弱AQP4表達，隨著培養時間延長，AQP4表達顯著增高；傳代培養9 d與原代培養9 d AQP4表達無顯著性差異，表明星形膠質細胞中AQP4表達水平處于相對穩定狀態。

Wen等[24]利用Westen blotting對大鼠出生后腦內AQP4表達進行研究，發現AQP4表達由生后7 d時的2%增加到生后14 d的25%。Li等[25]研究發現，小鼠腦內AQP4在生后1周表達量是成年小鼠腦內總表達量的21.3%，生后2周可以達到成年腦的67.4%。與我們觀察到的現象相似。研究AQP4在星形膠質細胞的表達，選擇適宜的培養時間非常重要。

總之，本研究發現，大鼠星形膠質細胞原代培養3 d就有AQP4表達，之后逐漸增加，9 d達穩定狀態，適宜進行AQP4在星形膠質細胞生理及病理條件下的相關研究。

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Expression ofAquaporin 4 inAstrocytes of Rats in Vitro

XU Li-xin1,2,DONG Li-ping1,2,SHI Zhong-fang1,2,YAN Xu1,2,YANG Shao-hua3,YUAN Fang1,2
1.Department of Pathophysiology,Beijing Neurosurgical Institute,Beijing 100050,China;2.Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China;3.Department of Pharmacology and Neuroscience,University of North Texas Health Science Center,Fort Worth,Texas 76107,USA

DONG Li-ping.E-mail:d08270827@163.com

Objective To explore the expression of aquaporin 4(AQP4)in primary and secondary cultured rat astrocytes.Methods Rat cortical astrocytes from a newborn(one day)Wistar rat were cultured.Astrocytes were identified with immunofluorescence staining of glial fibrilillary acidic protein(GFAP).The expression of AQP4 was determined with real-time quantitative polymerase chain reaction and immunofluorescence staining three,five,seven and nine days of primary culture,and nine days of secondary culture.Results The purity of GFAP-positive cells was more than 95%.The expression of AQP4 mRNA was found three days of primary culture,remained unchanged five days of primary culture(P＞0.05),and increased seven and nine days of primary culture(P＜0.05).The expression of AQP4 mRNA was not different between nine days of primary culture and nine days of secondary culture(P＞0.05).AQP4 immunofluorescence staining showed the same trend of AQP4 mRNA.Conclusion AQP4 may express since three days of primary culture in rat astrocytes in vitro,and increase slowly until nine days of primary culture.

aquaporin 4;astrocyte;cell culture;rats

R338.2

A

1006-9771(2017)09-1051-05

2017-05-17

2017-06-22)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.09.012

[本文著錄格式] 徐立新，董麗萍，師忠芳，等.體外培養大鼠星形膠質細胞水通道蛋白4的表達[J].中國康復理論與實踐,2017,23(9):1051-1055.

CITED AS:Xu LX,Dong LP,Shi ZF,et al.Expression of aquaporin 4 in astrocytes of rats in vitro[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(9):1051-1055.

1.國家自然科學基金項目(No.81271286)；2.北京市自然科學基金項目(No.7152027)。

1.北京市神經外科研究所病理生理室，北京市100050；2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京市100050；3.北德克薩斯大學醫學中心神經與藥理系，美國德克薩斯州沃思堡76107。作者簡介：徐立新(1966-)，女，漢族，北京市人，主管技師，主要研究方向：神經系統相關疾病基礎研究。通訊作者：董麗萍，女，研究員。E-mail:d08270827@163.com。