洋桔梗小孢子培養胚性愈傷組織誘導

賈茸　朱永平　江周

摘要：研究了影響洋桔梗小孢子培養中胚性愈傷組織形成的主要因素，旨在建立其高頻胚性愈傷組織體系。結果發現，基因型是影響洋桔梗小孢子發生胚性愈傷組織的關鍵因素，不同基因型間誘導率不同，供試材料中3份誘導出胚性愈傷組織，其中香檳601出愈率最高，達到4.86個/朵；4 ℃低溫處理1～3 d均能顯著提高胚性愈傷組織的出愈率，最佳處理時間是1 d。32 ℃熱激處理對于提高胚性愈傷組織出愈率有一定的影響，但較低溫處理不明顯。適合多個洋桔梗基因型誘導胚性愈傷組織的最佳誘導培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA。

關鍵詞：洋桔梗；小孢子培養；胚性愈傷組織；影響因素

中圖分類號： S682.1+90.4+3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0039-03

洋桔梗（Eustoma grandiflorum）別稱德州蘭鈴、草原龍膽、麗缽花，為龍膽科草原龍膽屬的宿根草本花卉，原產于美洲墨西哥、美國中南部等地[1]。洋桔梗花色繁多，花姿優美，極具觀賞價值，是世界花卉領域極具發展前途的品種之一。目前，我國的洋桔梗F1代種子都從國外進口，不僅價格高昂，而且后代分離嚴重，不能留種，給洋桔梗的商業化生產帶來了較大阻礙。

洋桔梗常規育種耗時長，效率低，獲得純合自交系需要 6～8年自交與選擇，而通過游離小孢子培養可以在短期內獲得單倍體植株，快速純合育種材料，縮短育種周期，加快育種進程[2]。目前游離小孢子培養技術已在甘藍型油菜[3]、辣椒[4]、大白菜[5]、白菜[6]、水稻[7]、小麥[8]等作物成功建立了游離小孢子的培養體系，成為重要的育種方法，而迄今關于洋桔梗游離小孢子培養體系的研究還鮮有報道。

本試驗研究了基因型、4 ℃低溫處理、32 ℃熱激處理、激素處理等4個因素對其胚性愈傷組織發生的影響，旨在建立較高愈傷組織誘導率的培養途徑，為后期分化成苗提供足夠多的材料，推進洋桔梗游離小孢子培養體系的快速建立，為單倍體育種奠定一定的基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗在2014年10月28日開始進行，于云南省農業科學院玉溪基地采摘紅色401、粉色503、香檳601、藍色601和藍霧401等5個不同基因型洋桔梗，材料在大棚內種植，采用的是常規的田間管理。

1.2試驗方法

1.2.1材料選擇取樣時間為晴朗天氣的09：00—10：00，從生長旺盛的洋桔梗植株上采取綠色飽滿、花萼與花冠等長或者花萼略短于花冠的新鮮花蕾。處于該形態特征的花蕾，其小孢子絕大部分處于單核靠邊期，在前期的試驗中已經證實了洋桔梗花蕾的該形態特征與其小孢子發育時期相關的這一特性。

1.2.2外植體處理洗潔精水清洗花蕾10 min，流水沖洗30 min，然后在超凈工作臺中用75%乙醇浸洗10 min，10.5% NaClO處理8 min，無菌水沖洗5 次，每次3 min，瀝干水分，待用。

1.2.3小孢子提取、純化用小鑷子將花蕾剝開，取出花藥，清理花絲，置于無菌研缽中，加入適量B5溶液，用研棒充分碾壓花藥，分離出小孢子，后在雙層漏斗中加300目消毒濾網過濾，濾液收納于5 mL離心管中，轉速1 200 r/min，離心3次，時間分別為12、8、5 min，棄B5上清液，按每蕾加入3 mL相應MS液體培養液，將沉淀物搖勻，用移液槍取1.0 mL于MS固體培養基上，再加入2 mL相應MS液體培養液。

1.2.4試驗設計試驗從以下4個因素探討其對洋桔梗小孢子誘導胚性愈傷組織的影響：

（1）不同基因型。以5個不同基因型的洋桔梗為試材，每3瓶接種1個花蕾的小孢子，在相同條件下進行培養，每個處理重復3次。

（2）4 ℃低溫處理。接種前把部分洋桔梗的花蕾放在4 ℃冰箱中進行低溫預處理，處理時間分別為1、2、3 d，以未經低溫處理的洋桔梗為對照，每個處理重復3次。

（3）32 ℃熱激處理。小孢子接種到瓶后，將其放在32 ℃恒溫培養箱中進行熱激處理，處理時間分別為1、2、3 d，以未經低溫處理的洋桔梗為同一對照，每個處理重復3次。

（4）激素處理。以MS為基本培養基，添加6.5 g/L瓊脂、30 g/L蔗糖。分別添加不同濃度的激素6-BA、KT、2，4-D和NAA，pH值調節到5.8，配制不同組合的愈傷組織培養基，每個處理重復3次，設計正交試驗L9（34），結果見表1。

1.2.5數據分析所得數據采用SPSS軟件進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1基因型對小孢子胚性愈傷組織誘導影響

供體植株基因型與小孢子愈傷組織的獲得有密切關系。在供試的5個基因型中有2個基因型沒有誘導出愈傷組織，3個基因型誘導出愈傷組織，誘導率占60%。其中，香檳601最先出現胚性愈傷組織且出愈率最高，達到4.86個/朵，單瓶最高產愈數為12個；粉色503出愈率達到2.59個/朵，而紅色401較差，僅為0.98個/朵，單瓶最大只有3個。香檳601平均每朵花蕾出愈數是紅色401的4.94倍、粉色503的1.88倍，而藍色601和藍霧401始終沒有誘導出胚性愈傷組織，基因型間大體差異顯著（表2）。表明洋桔梗基因型是影響其小孢子愈傷組織培養的一個重要因素。

2.24 ℃低溫預處理對洋桔梗小孢子胚性愈傷組織的誘導影響

在接種前對洋桔梗花蕾進行4 ℃低溫預處理獲得的小孢子胚性愈傷組織比對照組多，說明對洋桔梗的花蕾進行一定時間的低溫處理能提高小孢子愈傷組織發生頻率。紅色401、粉色503和香檳601分別在4 ℃低溫條件下預處理1、2、3 d時均獲得了胚性愈傷組織，均比未經處理的對照組的出愈率高，且以經4 ℃低溫預處理1 d獲得愈傷組織的概率最大。其中，紅色401達到3.11個/朵，粉色503達到7.00個/朵，香檳601達到12.11個/朵，分別是對照的9.42、12.50、7.25 倍。隨著處理時間的持續，低溫處理有利于愈傷組織誘導的作用越來越不明顯，處理3 d后，3種基因型的誘導率均下降（表3）。由此說明對洋桔梗花蕾進行一定時間的低溫預處理是有必要的，且以處理1 d效果最佳。

2.332 ℃熱激處理對洋桔梗小孢子胚性愈傷組織誘導的影響

32 ℃熱激處理對洋桔梗小孢子胚性愈傷組織的獲得有一定效果。熱激1 d時，獲得的胚性愈傷組織數低于對照，隨著處理時間的延長，獲得的胚性愈傷組織漸多，以處理3 d達到最大值，其中紅色401愈傷組織率達到0.78個/朵，粉色503達到1.44個/朵，香檳601達到3.33個/朵，分別是對照的2.36、2.57、1.99倍（表4）。雖然熱激處理對于提高愈傷組織誘導率有效果，但是與4 ℃低溫預處理相比，差異較大。由此說明32 ℃熱激處理對于洋桔梗小孢子胚性愈傷組織的影響不明顯。

2.4激素處理對洋桔梗小孢子胚性愈傷組織率的影響

同一基因型的小孢子在不同激素處理上的出愈率以及不同基因型在相同激素處理上出愈率存在差異（表5）。紅色401在5號激素處理上獲得的胚性愈傷組織率最高，為2.43個/朵，在2號和4號激素處理中沒有獲得出胚性愈傷組織；粉色503出愈率最大是在5號激素處理上，達到6.86個/朵，在2號激素處理的誘導率為0；而香檳601在9種處理中均誘導出胚性愈傷組織，在5號激素處理中出愈率最大，達到886個/朵，在4號激素處理中最小，僅為2.14個/朵。

紅色401小孢子誘導胚性愈傷組織的激素極差大小順序為RC>RB>RD>RA，即影響愈傷組織誘導的激素大小順序為2，4-D>KT>NAA>6-BA，其中2，4-D的k3最大，即濃度為2.0 mg/L；KT的k3略大于k2，考慮到成本，最佳濃度取1.0 mg/L；NAA的k2最大，濃度為0.2 mg/L；6-BA的k2最大，濃度為1.0 mg/L。由此確定紅色401小孢子產生胚性愈傷組織的最佳培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA，影響粉色503和香檳601胚性愈傷組織誘導的激素大小順序分別為2，4-D>KT>6-BA>NAA和2，4-D>KT>NAA>6-BA，最佳培養基同為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA（表6）。由此說明雖然激素種類對洋[CM（25]桔梗不同基因型小孢子培養誘導愈傷組織的影響大小不一致，但在某一培養基配方中，不同基因型洋桔梗胚性愈傷組織的誘導均能達到經濟、高效的結果。因此，篩選出適合洋桔梗小孢子胚性愈傷組織誘導的最佳激素組合為5號，即MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA。

3討論與結論

供試材料的基因型是影響小孢子培養的主要因素之一，決定著小孢子培養中產生的愈傷組織的數量和質量，這一現象在多種作物的小孢子培養中普遍存在[9-10]。本試驗供試的5個不同基因型洋桔梗材料中有3個誘導出愈傷組織，其他2個材料即便采取了不同溫度、時間、激素組合等多種處理措施，也依舊無法誘導出愈傷組織，這可能是因為不同基因型洋桔梗材料的游離小孢子對離體培養的敏感度不同而產生的差異，有些材料容易得到愈傷組織，有些材料不容易或者不能得到愈傷組織，因而要特別重視對供體植株基因型的篩選。

已有研究表明，低溫預處理花蕾，能從不同程度上促進胚性愈傷組織的誘導，這已經成為小孢子培養中普遍采用的一個重要步驟[11-12]。Duncan等發現，低溫預處理不僅可以使花粉退化速度減慢，還能誘導更多花粉啟動新的細胞周期，從而促使更多小孢子參與反應[13]。Burgin等分析認為，煙草花蕾經低溫處理后，小孢子分裂指數顯著上升[14]。本試驗通過4 ℃低溫預處理花蕾1、2、3 d獲得的愈傷組織明顯較對照多，其中以預處理1 d的效果最佳，隨著處理時間的延續，得到的愈傷組織更少。可能是小孢子因長時間的低溫預處理消耗過多營養以維持代謝，造成了自身活力的下降甚至死亡。因此，低溫處理對誘導洋桔梗產生胚性愈傷組織有良好的效果。

董艷榮等認為，熱激處理改變了小孢子的分裂方式，促使其形成孢子體而非成熟的花粉[15]。Telmer等研究發現，在甘藍型油菜游離小孢子培養中必須采用高溫熱激處理，而且 32 ℃ 熱激處理小孢子3 d，會使其具有較強的分化能力[16]。本試驗中采用32 ℃熱激處理1～3 d，獲得的愈傷組織數較對照有顯著提升，但相比低溫預處理效果而言差距很大。可能是因為熱激處理雖然可以明顯促進小孢子的發育途徑的轉變，但不同作物處理溫度也不盡相同，洋桔梗須要在更高溫度或更長時間方面加以嘗試。也有可能是洋桔梗對高溫反應遲鈍，所以熱激處理不能引起小孢子理化性質的改變，促使其分化。

在多種作物的游離小孢子培養中，為了提高愈傷組織的發生率，會在適宜范圍內向培養基中添加不同的激素種類和濃度。小孢子培養時通常通過添加2，4-D、NAA、IAA等生長素和KT、6-BA、ZT等細胞分裂素來調整小孢子的分裂、分化、愈傷組織的形成等，由于材料的區別，添加的激素種類和濃度各有不同，其最適的激素種類和濃度配比要經過多次試驗才能最終獲得[17-18]。本試驗結果也表明，不同激素組合處理對不同基因型洋桔梗小孢子獲得胚性愈傷組織的影響不同，其中以2，4-D的影響最大，濃度取2.0 mg/L；KT次之，濃度為1.0 mg/L；6-BA和NAA較基因型不同，影響的大小順序稍有差異，但最佳濃度相同，分別是1.0、0.2 mg/L。因此，該試驗篩選出的最佳洋桔梗游離小孢子培養誘導胚性愈傷組織的培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 m/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA。

通過本研究摸索出一些提高洋桔梗小孢子誘導胚性愈傷組織的因素，但是影響洋桔梗游離小孢子培養的因素還有很多，如培養方式、供體植株生長條件和生理狀況、培養基組分、碳源種類和濃度、活性炭等，每個環節的細微變化都可能會影響出愈率。因此，為了培育出洋桔梗的單倍體植株獲得雙單倍體即構建DH系還須要進一步研究。

參考文獻：

[1]李昀輝. 草原龍膽生物學特性及遺傳研究[D]. 哈爾濱：東北林業大學，2004.

[2]丁兵，王江. 草原龍膽種苗繁育及優質切花生產技術[J].

種子世界，2006（9）：42.

[3]劉雪平，劉志文，涂金星，等. 甘藍型油菜小孢子培養技術的幾項改進[J]. 遺傳，2003，25（4）：433-436.

[4]戈偉，王述彬，劉金兵，等. 辣椒小孢子培養主要影響因素的研究進展[J]. 江蘇農業科學，2009（4）：165-167.

[5]趙俊，巫東堂，趙軍良，等. 影響大白菜游離小孢子培養若干因素的研究[J]. 山西農業科學，2008，36（8）：26-28.

[6]崔群香，劉衛東，帥強，等. 小白菜小孢子培養技術研究進展[J]. 金陵科技學院學報，2009，25（3）：77-81.

[7]王玲仙，藺忠龍，白現廣，等. 水稻游離小孢子培養最新研究進展[J]. 生物技術，2009，19（6）：92-95.

[8]秦余香，夏光敏. 小麥的小孢子培養[J]. 植物學通報，2004，21（5）：625-630.

[9]耿建峰，侯喜林，張曉偉，等. 影響白菜游離小孢子培養關鍵因素分析[J]. 園藝學報，2007，34（1）：111-116.

[10]李必元，葉國銳，王五宏，等. 結球白菜游離小孢子培養與植株再生[J]. 浙江農業科學，2012，53（4）：503-506.

[11]白小娟，張麗，許明. 預處理對蘿卜離體小孢子發育的影響[J]. 西北農業學報，2008，17（3）：254-257，279.

[12]周廣棟，王秀峰，謝冰，等. 番茄花藥離體培養中低溫預處理對小孢子發育的影響[J]. 中國農學通報，2005，21（2）：192-195.

[13]Duncan E J，Heberl E. Effect of temperature shock on nuclear phenomena in microspores of Nicotiana tobacum and consequently on plantlet production[J]. Protoplasma，1976，90（3）：173-177.

[14]Burgin J P，Nitsch J P. Obtention de Nicotiana haplodes a partir d′étamines cultivées in vitro[J]. Ann Physiol Veg，1967（9）：377-382.

[15]董艷榮，龔義勤. 茄果類蔬菜花藥和花粉培養研究進展[J]. 長江蔬菜，2001（5）：30-32.

[16]Telmer C A，Newcomb W，Simmonds D H. Cellular changes during heat shock induction and embryo development of cultured microspores of Brassica napus cv. topas[J]. Protoplasma，1995，109（185）：106-112.

[17]王濤濤，李漢霞，張繼紅，等. 紅菜薹游離小孢子培養與植株再生[J]. 武漢植物學研究，2004，22（6）：569-571.

[18]趙前程，吉立柱，蔡榮旗，等. 花椰菜游離小孢子培養及植株再生研究[J]. 華北農學報，2007，22（6）：65-68.