洋桔梗小孢子培養(yǎng)胚性愈傷組織誘導(dǎo)

賈茸　朱永平　江周

摘要：研究了影響洋桔梗小孢子培養(yǎng)中胚性愈傷組織形成的主要因素，旨在建立其高頻胚性愈傷組織體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因型是影響洋桔梗小孢子發(fā)生胚性愈傷組織的關(guān)鍵因素，不同基因型間誘導(dǎo)率不同，供試材料中3份誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，其中香檳601出愈率最高，達(dá)到4.86個(gè)/朵；4 ℃低溫處理1～3 d均能顯著提高胚性愈傷組織的出愈率，最佳處理時(shí)間是1 d。32 ℃熱激處理對(duì)于提高胚性愈傷組織出愈率有一定的影響，但較低溫處理不明顯。適合多個(gè)洋桔梗基因型誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA。

關(guān)鍵詞：洋桔梗；小孢子培養(yǎng)；胚性愈傷組織；影響因素

中圖分類號(hào)： S682.1+90.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）14-0039-03

洋桔梗（Eustoma grandiflorum）別稱德州蘭鈴、草原龍膽、麗缽花，為龍膽科草原龍膽屬的宿根草本花卉，原產(chǎn)于美洲墨西哥、美國(guó)中南部等地[1]。洋桔梗花色繁多，花姿優(yōu)美，極具觀賞價(jià)值，是世界花卉領(lǐng)域極具發(fā)展前途的品種之一。目前，我國(guó)的洋桔梗F1代種子都從國(guó)外進(jìn)口，不僅價(jià)格高昂，而且后代分離嚴(yán)重，不能留種，給洋桔梗的商業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)了較大阻礙。

洋桔梗常規(guī)育種耗時(shí)長(zhǎng)，效率低，獲得純合自交系需要 6～8年自交與選擇，而通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)可以在短期內(nèi)獲得單倍體植株，快速純合育種材料，縮短育種周期，加快育種進(jìn)程[2]。目前游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)已在甘藍(lán)型油菜[3]、辣椒[4]、大白菜[5]、白菜[6]、水稻[7]、小麥[8]等作物成功建立了游離小孢子的培養(yǎng)體系，成為重要的育種方法，而迄今關(guān)于洋桔梗游離小孢子培養(yǎng)體系的研究還鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)研究了基因型、4 ℃低溫處理、32 ℃熱激處理、激素處理等4個(gè)因素對(duì)其胚性愈傷組織發(fā)生的影響，旨在建立較高愈傷組織誘導(dǎo)率的培養(yǎng)途徑，為后期分化成苗提供足夠多的材料，推進(jìn)洋桔梗游離小孢子培養(yǎng)體系的快速建立，為單倍體育種奠定一定的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在2014年10月28日開(kāi)始進(jìn)行，于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉溪基地采摘紅色401、粉色503、香檳601、藍(lán)色601和藍(lán)霧401等5個(gè)不同基因型洋桔梗，材料在大棚內(nèi)種植，采用的是常規(guī)的田間管理。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1材料選擇取樣時(shí)間為晴朗天氣的09：00—10：00，從生長(zhǎng)旺盛的洋桔梗植株上采取綠色飽滿、花萼與花冠等長(zhǎng)或者花萼略短于花冠的新鮮花蕾。處于該形態(tài)特征的花蕾，其小孢子絕大部分處于單核靠邊期，在前期的試驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)了洋桔梗花蕾的該形態(tài)特征與其小孢子發(fā)育時(shí)期相關(guān)的這一特性。

1.2.2外植體處理洗潔精水清洗花蕾10 min，流水沖洗30 min，然后在超凈工作臺(tái)中用75%乙醇浸洗10 min，10.5% NaClO處理8 min，無(wú)菌水沖洗5 次，每次3 min，瀝干水分，待用。

1.2.3小孢子提取、純化用小鑷子將花蕾剝開(kāi)，取出花藥，清理花絲，置于無(wú)菌研缽中，加入適量B5溶液，用研棒充分碾壓花藥，分離出小孢子，后在雙層漏斗中加300目消毒濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液收納于5 mL離心管中，轉(zhuǎn)速1 200 r/min，離心3次，時(shí)間分別為12、8、5 min，棄B5上清液，按每蕾加入3 mL相應(yīng)MS液體培養(yǎng)液，將沉淀物搖勻，用移液槍取1.0 mL于MS固體培養(yǎng)基上，再加入2 mL相應(yīng)MS液體培養(yǎng)液。

1.2.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)從以下4個(gè)因素探討其對(duì)洋桔梗小孢子誘導(dǎo)胚性愈傷組織的影響：

（1）不同基因型。以5個(gè)不同基因型的洋桔梗為試材，每3瓶接種1個(gè)花蕾的小孢子，在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

（2）4 ℃低溫處理。接種前把部分洋桔梗的花蕾放在4 ℃冰箱中進(jìn)行低溫預(yù)處理，處理時(shí)間分別為1、2、3 d，以未經(jīng)低溫處理的洋桔梗為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

（3）32 ℃熱激處理。小孢子接種到瓶后，將其放在32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行熱激處理，處理時(shí)間分別為1、2、3 d，以未經(jīng)低溫處理的洋桔梗為同一對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

（4）激素處理。以MS為基本培養(yǎng)基，添加6.5 g/L瓊脂、30 g/L蔗糖。分別添加不同濃度的激素6-BA、KT、2，4-D和NAA，pH值調(diào)節(jié)到5.8，配制不同組合的愈傷組織培養(yǎng)基，每個(gè)處理重復(fù)3次，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34），結(jié)果見(jiàn)表1。

1.2.5數(shù)據(jù)分析所得數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1基因型對(duì)小孢子胚性愈傷組織誘導(dǎo)影響

供體植株基因型與小孢子愈傷組織的獲得有密切關(guān)系。在供試的5個(gè)基因型中有2個(gè)基因型沒(méi)有誘導(dǎo)出愈傷組織，3個(gè)基因型誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)率占60%。其中，香檳601最先出現(xiàn)胚性愈傷組織且出愈率最高，達(dá)到4.86個(gè)/朵，單瓶最高產(chǎn)愈數(shù)為12個(gè)；粉色503出愈率達(dá)到2.59個(gè)/朵，而紅色401較差，僅為0.98個(gè)/朵，單瓶最大只有3個(gè)。香檳601平均每朵花蕾出愈數(shù)是紅色401的4.94倍、粉色503的1.88倍，而藍(lán)色601和藍(lán)霧401始終沒(méi)有誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，基因型間大體差異顯著（表2）。表明洋桔梗基因型是影響其小孢子愈傷組織培養(yǎng)的一個(gè)重要因素。

2.24 ℃低溫預(yù)處理對(duì)洋桔梗小孢子胚性愈傷組織的誘導(dǎo)影響

在接種前對(duì)洋桔梗花蕾進(jìn)行4 ℃低溫預(yù)處理獲得的小孢子胚性愈傷組織比對(duì)照組多，說(shuō)明對(duì)洋桔梗的花蕾進(jìn)行一定時(shí)間的低溫處理能提高小孢子愈傷組織發(fā)生頻率。紅色401、粉色503和香檳601分別在4 ℃低溫條件下預(yù)處理1、2、3 d時(shí)均獲得了胚性愈傷組織，均比未經(jīng)處理的對(duì)照組的出愈率高，且以經(jīng)4 ℃低溫預(yù)處理1 d獲得愈傷組織的概率最大。其中，紅色401達(dá)到3.11個(gè)/朵，粉色503達(dá)到7.00個(gè)/朵，香檳601達(dá)到12.11個(gè)/朵，分別是對(duì)照的9.42、12.50、7.25 倍。隨著處理時(shí)間的持續(xù)，低溫處理有利于愈傷組織誘導(dǎo)的作用越來(lái)越不明顯，處理3 d后，3種基因型的誘導(dǎo)率均下降（表3）。由此說(shuō)明對(duì)洋桔梗花蕾進(jìn)行一定時(shí)間的低溫預(yù)處理是有必要的，且以處理1 d效果最佳。

2.332 ℃熱激處理對(duì)洋桔梗小孢子胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

32 ℃熱激處理對(duì)洋桔梗小孢子胚性愈傷組織的獲得有一定效果。熱激1 d時(shí)，獲得的胚性愈傷組織數(shù)低于對(duì)照，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，獲得的胚性愈傷組織漸多，以處理3 d達(dá)到最大值，其中紅色401愈傷組織率達(dá)到0.78個(gè)/朵，粉色503達(dá)到1.44個(gè)/朵，香檳601達(dá)到3.33個(gè)/朵，分別是對(duì)照的2.36、2.57、1.99倍（表4）。雖然熱激處理對(duì)于提高愈傷組織誘導(dǎo)率有效果，但是與4 ℃低溫預(yù)處理相比，差異較大。由此說(shuō)明32 ℃熱激處理對(duì)于洋桔梗小孢子胚性愈傷組織的影響不明顯。

2.4激素處理對(duì)洋桔梗小孢子胚性愈傷組織率的影響

同一基因型的小孢子在不同激素處理上的出愈率以及不同基因型在相同激素處理上出愈率存在差異（表5）。紅色401在5號(hào)激素處理上獲得的胚性愈傷組織率最高，為2.43個(gè)/朵，在2號(hào)和4號(hào)激素處理中沒(méi)有獲得出胚性愈傷組織；粉色503出愈率最大是在5號(hào)激素處理上，達(dá)到6.86個(gè)/朵，在2號(hào)激素處理的誘導(dǎo)率為0；而香檳601在9種處理中均誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，在5號(hào)激素處理中出愈率最大，達(dá)到886個(gè)/朵，在4號(hào)激素處理中最小，僅為2.14個(gè)/朵。

紅色401小孢子誘導(dǎo)胚性愈傷組織的激素極差大小順序?yàn)镽C>RB>RD>RA，即影響愈傷組織誘導(dǎo)的激素大小順序?yàn)?，4-D>KT>NAA>6-BA，其中2，4-D的k3最大，即濃度為2.0 mg/L；KT的k3略大于k2，考慮到成本，最佳濃度取1.0 mg/L；NAA的k2最大，濃度為0.2 mg/L；6-BA的k2最大，濃度為1.0 mg/L。由此確定紅色401小孢子產(chǎn)生胚性愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA，影響粉色503和香檳601胚性愈傷組織誘導(dǎo)的激素大小順序分別為2，4-D>KT>6-BA>NAA和2，4-D>KT>NAA>6-BA，最佳培養(yǎng)基同為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA（表6）。由此說(shuō)明雖然激素種類對(duì)洋[CM（25]桔梗不同基因型小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織的影響大小不一致，但在某一培養(yǎng)基配方中，不同基因型洋桔梗胚性愈傷組織的誘導(dǎo)均能達(dá)到經(jīng)濟(jì)、高效的結(jié)果。因此，篩選出適合洋桔梗小孢子胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳激素組合為5號(hào)，即MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA。

3討論與結(jié)論

供試材料的基因型是影響小孢子培養(yǎng)的主要因素之一，決定著小孢子培養(yǎng)中產(chǎn)生的愈傷組織的數(shù)量和質(zhì)量，這一現(xiàn)象在多種作物的小孢子培養(yǎng)中普遍存在[9-10]。本試驗(yàn)供試的5個(gè)不同基因型洋桔梗材料中有3個(gè)誘導(dǎo)出愈傷組織，其他2個(gè)材料即便采取了不同溫度、時(shí)間、激素組合等多種處理措施，也依舊無(wú)法誘導(dǎo)出愈傷組織，這可能是因?yàn)椴煌蛐脱蠼酃２牧系挠坞x小孢子對(duì)離體培養(yǎng)的敏感度不同而產(chǎn)生的差異，有些材料容易得到愈傷組織，有些材料不容易或者不能得到愈傷組織，因而要特別重視對(duì)供體植株基因型的篩選。

已有研究表明，低溫預(yù)處理花蕾，能從不同程度上促進(jìn)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，這已經(jīng)成為小孢子培養(yǎng)中普遍采用的一個(gè)重要步驟[11-12]。Duncan等發(fā)現(xiàn)，低溫預(yù)處理不僅可以使花粉退化速度減慢，還能誘導(dǎo)更多花粉啟動(dòng)新的細(xì)胞周期，從而促使更多小孢子參與反應(yīng)[13]。Burgin等分析認(rèn)為，煙草花蕾經(jīng)低溫處理后，小孢子分裂指數(shù)顯著上升[14]。本試驗(yàn)通過(guò)4 ℃低溫預(yù)處理花蕾1、2、3 d獲得的愈傷組織明顯較對(duì)照多，其中以預(yù)處理1 d的效果最佳，隨著處理時(shí)間的延續(xù)，得到的愈傷組織更少。可能是小孢子因長(zhǎng)時(shí)間的低溫預(yù)處理消耗過(guò)多營(yíng)養(yǎng)以維持代謝，造成了自身活力的下降甚至死亡。因此，低溫處理對(duì)誘導(dǎo)洋桔梗產(chǎn)生胚性愈傷組織有良好的效果。

董艷榮等認(rèn)為，熱激處理改變了小孢子的分裂方式，促使其形成孢子體而非成熟的花粉[15]。Telmer等研究發(fā)現(xiàn)，在甘藍(lán)型油菜游離小孢子培養(yǎng)中必須采用高溫?zé)峒ぬ幚恚?32 ℃ 熱激處理小孢子3 d，會(huì)使其具有較強(qiáng)的分化能力[16]。本試驗(yàn)中采用32 ℃熱激處理1～3 d，獲得的愈傷組織數(shù)較對(duì)照有顯著提升，但相比低溫預(yù)處理效果而言差距很大。可能是因?yàn)闊峒ぬ幚黼m然可以明顯促進(jìn)小孢子的發(fā)育途徑的轉(zhuǎn)變，但不同作物處理溫度也不盡相同，洋桔梗須要在更高溫度或更長(zhǎng)時(shí)間方面加以嘗試。也有可能是洋桔梗對(duì)高溫反應(yīng)遲鈍，所以熱激處理不能引起小孢子理化性質(zhì)的改變，促使其分化。

在多種作物的游離小孢子培養(yǎng)中，為了提高愈傷組織的發(fā)生率，會(huì)在適宜范圍內(nèi)向培養(yǎng)基中添加不同的激素種類和濃度。小孢子培養(yǎng)時(shí)通常通過(guò)添加2，4-D、NAA、IAA等生長(zhǎng)素和KT、6-BA、ZT等細(xì)胞分裂素來(lái)調(diào)整小孢子的分裂、分化、愈傷組織的形成等，由于材料的區(qū)別，添加的激素種類和濃度各有不同，其最適的激素種類和濃度配比要經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)才能最終獲得[17-18]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，不同激素組合處理對(duì)不同基因型洋桔梗小孢子獲得胚性愈傷組織的影響不同，其中以2，4-D的影響最大，濃度取2.0 mg/L；KT次之，濃度為1.0 mg/L；6-BA和NAA較基因型不同，影響的大小順序稍有差異，但最佳濃度相同，分別是1.0、0.2 mg/L。因此，該試驗(yàn)篩選出的最佳洋桔梗游離小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)胚性愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 m/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA。

通過(guò)本研究摸索出一些提高洋桔梗小孢子誘導(dǎo)胚性愈傷組織的因素，但是影響洋桔梗游離小孢子培養(yǎng)的因素還有很多，如培養(yǎng)方式、供體植株生長(zhǎng)條件和生理狀況、培養(yǎng)基組分、碳源種類和濃度、活性炭等，每個(gè)環(huán)節(jié)的細(xì)微變化都可能會(huì)影響出愈率。因此，為了培育出洋桔梗的單倍體植株獲得雙單倍體即構(gòu)建DH系還須要進(jìn)一步研究。

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