蘇云金芽孢桿菌BJH705菌株cry7Ab基因的克隆及表達

韓超　王麗娟　李海濤

摘要：從海南地區土壤中分離得到1株蘇云金芽孢桿菌（Bt）BJH705。經PCR鑒定結果顯示，該菌中含有cry7Ab類基因，其晶體形態為雙錐形；以全長引物對其進行擴增，得到大小為3 417 bp的片段；通過SDS-PAGE結果顯示，此菌株Cry7Ab殺蟲晶體蛋白分子量約為130 ku，編碼1 139個氨基酸殘基，等電點為4.83；序列已提交GenBank注冊，登錄號為KX010669；對Cry7Ab蛋白的跨膜區域進行分析，得到此蛋白由親水域和疏水域形成跨膜區，其跨膜區大約由19個疏水氨基酸組成，經Cry7Ab蛋白保守結構域分析含有3個結構域。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；cry7Ab基因；克隆；表達；殺蟲晶體蛋白

中圖分類號： Q786文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0085-03

在世界范圍內廣泛分布著一種革蘭氏陽性菌——蘇云金芽孢桿菌（Bt），其歸類于芽孢桿菌科芽孢桿菌屬[1]。它的母細胞會在形成芽孢的同時伴隨著形成晶體蛋白，稱之為伴胞晶體，伴胞晶體呈現立方體、球形、菱形、鑲嵌形、無定形，是具有殺傷活力的殺蟲晶體蛋白。

由cry7類基因編碼的蛋白的分子量約為130 ku，晶體一般為雙錐形。到目前為止，Crickmore（http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/）上已經登錄了cry7類21種基因，共37個，其中包含9個cry7Ab基因。但是關于cry7類基因的殺蟲活性卻很少被報道，有研究發現，cry7類基因可以編碼對鞘翅目害蟲有活性的蛋白；據相關的研究表明，Cry7Ab3蛋白對馬鈴薯甲蟲有較高的殺蟲活性[2]。Cry7Ab4蛋白胰蛋白酶（trypsin）酶解液對鞘翅目的大猿葉甲（Colophellus bowringi）顯示出一定的殺蟲活性，但對鱗翅目的小菜蛾（Plutella xylostella）、甜菜夜蛾（Spadoptera exigua）、亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）、榆藍葉甲（Pyrrhalta aenescens）和直翅目的東亞飛蝗（Locusta migraloria manilensis）基本無殺蟲活性[3]。Cry7Ab8蛋白對馬鈴薯瓢蟲2齡幼蟲具有較高毒力，但對黃粉蟲沒有殺蟲活性，這可能是由于馬鈴薯瓢蟲和黃粉蟲的中腸所含的蛋白酶不同[4]。Cry7Ca1蛋白對飛蝗有殺蟲活性[5]。由于鞘翅目害蟲的危害日益嚴重，而長期以來我國采用農藥的防治方法給環境帶來了嚴重危害[6-9]，因此篩選和鑒定對鞘翅目害蟲有活性的基因極為重要。

1材料與方法

1.1材料

液體LB培養基：0.5%酵母粉，1.0%胰蛋白胨，1.0% NaCl，pH值為7.0，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

固體LB培養基：0.5%酵母粉，1.0%胰蛋白胨，1.0% NaCl，1.3%瓊脂，pH值為7.0，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

Taq DNA聚合酶、KOD酶、pMD19-T 載體、氨芐青霉素、X-Gal、IPTG、DNA marker、蛋白質分子量標準均購自TaKaRa公司；質粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自美國Axygen公司；引物由金維智生物工程（北京）有限公司合成；分析純化學試劑均為市售。

1.2方法

1.2.1土樣來源及Bt菌株的分離

土樣采自中國海南地區，采用溫度法[10]進行Bt菌株的篩選。

1.2.2Bt基因組的提取

分離純化后的Bt菌株在固體LB培養基上30 ℃過夜培養12 h，采用張彥蕊等的方法[11]提取基因組。

1.2.3cry7Ab基因的鑒定與克隆

根據GenBank上公布的cry7類基因的序列，利用primer 5設計cry7基因的鑒定引物cry7-F/cry7-R及cry7Ab全長的引物cry7Ab-F/cry7Ab-R，序列見表1（金唯智合成）。

利用cry7-F/cry7-R引物對，用Taq DNA聚合酶進行cry7基因的鑒定，PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃復性1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環；72 ℃ 延伸10 min。利用cry7Ab-F/cry7Ab-R引物對，用KOD酶進行cry7Ab全長基因擴增，PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性 15 s，52 ℃復性30 s，68 ℃延伸 3.5 min，30個循環；68 ℃延伸10 min。將上述PCR產物均用0.7%瓊脂糖進行電泳檢測，利用ChampGel 6000全自動凝膠成像系統（gel documentation and image analysis system）成像。

按照Axygen公司的膠回收試劑盒說明書進行擴增產物的回收純化。將回收的PCR產物分別連接pMD19-T克隆載體和pEB表達載體并轉入大腸桿菌（Escherichia coli） JM109中，篩選陽性克隆進行PCR驗證，以便確認是否連有目的片段。提取連接正確重組細菌的質粒送金維智生物工程（北京）有限公司進行序列測定。

1.2.4cry7Ab基因在大腸桿菌中的表達

提取上述陽性轉化子重組質粒轉入大腸桿菌BL21中，進行IPTG誘導表達。首先低溫離心收集誘導物并棄上清，用20 mmol/L Tris HCl（pH值為8.0）緩沖液懸浮細胞并進行超聲波破碎，取樣用于 SDS-PAGE 分析。大腸桿菌質粒DNA提取、連接、轉化方法參照王立光等的方法[12-14]，殺蟲晶體蛋白樣品制備和SDS-PAGE電泳檢測方法參見束長龍等的方法[15-17]，并進行蛋白分析。

1.2.5Cry7Ab蛋白的結構分析

首先通過DNAMAN分析Cry7Ab的氨基酸含量、蛋白的大小、等電點。再利用Expasy的ProtScale程序計算蛋白質的疏水性圖譜，運用www.cbs.dtu.dk/services/TMHMMM網站的在線工具TMHMMM分析蛋白的跨膜區。

2結果與分析

2.1菌株分離

將從采集的土樣中分離得到的菌株接種于1/2LB固體培養基中，36～48 h進行光學顯微鏡鏡檢觀察。培養到24 h后，菌落呈乳白色，46 h后晶體完全裂解。從圖1中可以看出，這個菌株的晶體形態為雙錐形（箭頭所指）。

2.2蘇云金芽孢桿菌cry7Ab基因的克隆

以實驗室保存菌株提取的基因組為模板，以引物對cry7-F/cry7-R 進行PCR鑒定，得到大小1 500 bp左右的片段（圖2）。以全長引物cry7Ab-F/cry7Ab-R對其進行擴增，通過測序得到3 417 bp的片段（圖3），與經報道過已知的cry7Ab基因的堿基相似度為98.30%，與已知Cry7Ab蛋白氨基酸的相似度為99.91%。

2.3Cry7蛋白的表達和結構分析

2.3.1Cry7Ab蛋白在大腸桿菌中的表達

將引物對 cry7Ab-F/cry7Ab-R擴增產物回收、連接pEB表達載體，轉化到JM109感受態細胞后經藍白斑篩選，挑取陽性克隆命名為705-Cry7Ab，并進行誘導表達。SDS-PAGE分析結果見圖4。cry7Ab基因在大腸桿菌中誘導表達產物的SDS-PAGE分析結果表明，該基因編碼130 ku左右的殺蟲晶體蛋白Cry7Ab，與推測的蛋白大小一致。

2.4氨基酸序列分析

用ExpasyProtParam工具預測cry7Ab編碼1 139個氨基酸殘基，表達的蛋白質大小約為130 ku，與已知的Cry7Ab蛋白氨基酸的相似度為99.91%。等電點pI為4.83，與預測結果相符。其中，Ala、Glu、Leu、Arg、Ser氨基酸含量最多，Asp、Phe、Lys、Gln、Trp這5種氨基酸含量為0。

2.5Cry7Ab蛋白的跨膜區域分析

利用expasy站點的氨基酸序列親水性和疏水性分析功能對Cry7Ab蛋白進行研究。Expasy的ProtScale程序計算蛋白質的疏水性，見圖5。1 000位點以前為主要的疏水區和親水交替區域，說明該區域的氨基酸可能為跨膜區域，可能形成了α螺旋束。再運用www.cbs.dtu.dk/services/TMHMMM網站的在線工具TMHMMM分析蛋白的跨膜區[18-20]，Cry7Ab蛋白的跨膜區分析結果如圖6所示，其跨膜區大約由19個疏水氨基酸組成。

2.7Cry7Ab蛋白保守結構域分析

[JP+1]通過NCBI Conserved Domain分析結果表明，δ-內毒素的C-末端結構域可能與碳水化合物結合功能相關，δ-內毒素的C-末端結構域是δ-內毒素活性區的一部分，這是由芽孢桿菌殺蟲毒素的細菌芽孢在形成過程中產生的。活化的內毒素與中腸上皮細胞結合，導致細胞裂解死亡。此激[CM（25]活區域的δ-內毒素由3個結構域組成，N-末端的螺旋結構域（Ⅰ）涉及膜插入和孔的形成，而第2、3個結構域（Ⅱ、Ⅲ）參與受體結合，結構域Ⅲ的結構類似于碳水化合物結合結構域。

3結論與討論

已知的cry7Ab3對馬鈴薯甲蟲有殺蟲活性，其中cry7Aa殺馬鈴薯甲蟲（LC50為13.1 μg/mL）[17]，cry7Ba1殺小菜蛾（3 d LC50為0.095 7 μg/ mL，5 d LC50為0.039 9 μg/mL）[18]，cry7Ca1對飛蝗有殺蟲活性（48 h LC50為4.73 μg/mL，72 h LC50為3.19 μg/mL）[19]，cry7Ab8對馬鈴薯瓢蟲2齡幼蟲具有較強的殺蟲活性，Cry7Ab4胰蛋白酶酶解液對鞘翅目害蟲的大猿葉甲有一定的殺蟲活性，其野生菌蛋白及表達蛋白酶解液LC50分別為231.59、293.79 μg/mL。

本研究以筆者所在實驗室從海南地區不同地點采集的土樣中分離得到的96株Bt野生菌為材料，經統計分析得出Bt的分布可能與土樣采集的密集程度、植被覆蓋種類等原因相關，并對這96株Bt菌株進行cry7Ab基因的鑒定。其中，從編號為BJH705菌株中成功克隆得到1株晶體形態為雙錐形的含有cry7Ab全長基因的菌株，片段大小為3 417 bp，克隆得到的cry7Ab基因與已知的cry7Ab3基因相似性為98.30%。序列已提交GenBank注冊，登錄號為KX010669。成功構建表達載體后，在大腸桿菌BL21中表達了130 ku左右大小的新型殺蟲蛋白，與預測結果大小相符，與已知的Cry7Ab蛋白氨基酸的相似度為99.91%，其中Asp、Phe、Lys、Gln、Trp這5種氨基酸的的含量為0，可能與Cry7Ab蛋白的活性相關。對Cry7Ab蛋白的跨膜區域進行分析，發現親水域與疏水域是相互交替的，大約由19個疏水氨基酸組成跨膜區。分析Cry7Ab蛋白保守結構域發現含有3個結構域，由此可以對此基因的結構及功能有進一步的了解[20-21]。

因此，本研究克隆得到的cry7Ab基因編碼的蛋白也許會對鞘翅目害蟲有較高的殺蟲活性，可以為Bt基礎研究及轉基因植物、Bt工程菌的構建提供新材料，為Bt新型基因的發掘及擴大殺蟲譜奠定基礎[22]。

參考文獻：

[1]Wu Y，Lei C F，Yi D，et al. Novel Bacillus thuringiensis δ-endotoxin active against Locusta migratoria manilensis[J]. Applied and Environmental Microbiology，2011，77（10）：3227-3233.

[2]Peng D，Wang F，Li N，et al. Single cysteine substitution in Bacillus thuringiensis Cry7Ba1 improves the crystal solubility and produces toxicity to Plutella xylostella larvae[J]. Environmental Microbiology，2011，13（10）：2820-2831.

[3]馮靜靜. 蘇云金桿菌cry7Ab8基因的克隆表達及工程菌構建[D]. 保定：河北農業大學，2011.

[4]Shu C L，Yan G X，Wang R Y，et al.Characterization of a novel cry8 gene specific to Melolonthidae pests：Holotrichia oblita and Holotrichia parallela[J]. ApplMicrobiol Biotechnol，2009，84（4）：701-707.

[5]Storer N P，Babcock J M，Edwards J M. Field measures of western corn rootworm （Coleoptera：Chrysomelidae） mor-tality caused by Cry34/35 Ab1 proteins expressed in maizeevent 59122 and implications for trait durability[J]. Journal of Economic Entomology，2006，99（4）：1381-1387.

[6]Song P，Wang Q Y，Nangong Z Y，et al. Identification of Henosepilachna vigintioctomaculata （Coleoptera：Coccinellidae） midgut putative receptor for Bacillus thuringiensis insecticidal Cry7Ab3 toxin[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2012，109（3）：318-322.

[7]Huang T P，Ying X，Jie-Ru P A N，et al. Aerobic Cr（Ⅵ） reduction by an indigenous soil isolate Bacillus thuringiensis BRC-ZYR2[J]. Pedosphere，2014，24（5）：652-661.

[8]Nazarian A，Jahangiri R，Jouzani G S，et al. Coleopteran-specific and putative novel cry genes in Iranian native Bacillus thuringiensis collection[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2009，102（2）：101-109.

[9]Anon T，Tipvadee A. PCR-based method for the detection of cry genes in local isolates of Bacillus thuringiensis from Thailand[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2008，98（2）：121-126.

[10]喻子牛. 蘇云金芽孢桿菌[M]. 北京：科學出版社，1990：305-323.

[11]張彥蕊，束長龍，宋福平，等. 一種簡單、快速的蘇云金芽胞桿菌基因組DNA提取方法[J]. 生物技術通報，2012（11）：197-201.

[12]王立光. 蘇云金桿菌cry7Ab7基因的克隆表達及融合基因和工程菌構建[D]. 保定：河北農業大學，2010.

[13]劉晶晶，束長龍，張杰，等. 蘇云金芽孢桿菌內生質粒提取方法的改進[J]. 生物技術通報，2008（6）：120-123.

[14]宋萍，郭麗偉，蘇俊平，等. 含cry7類基因的蘇云金芽胞桿菌菌株的分析[J]. 華北農學報，2010，25（4）：40-43.

[15]束長龍，谷少華，竇黎明，等. 對小地老虎具有殺蟲毒力的蘇云金芽胞桿菌菌株的分離及鑒定[J]. 植物保護，2007，33（5）：41.

[16]林毅，方光偉. 紅樹林沉積物Bt菌株的分離與cry基因型的鑒定[J]. 生態毒理學報，2010，5（6）：889-893.

[17]李海濤，曲步云，趙世源，等. 蘇云金芽胞桿菌cry7Ab9基因的克隆與殺蟲活性的測定[J]. 湖南師范大學自然科學學報，2013，36（2）：68-72.

[18]Gao M，Li R，Dai S，et al. Diversity of Bacillus thuringiensis strains from soil in China and their pesticidal activities[J]. Biological Control，2008，44（3）：380-388.

[19]鄧淑，束長龍，林毅，等. 新型cry7Ab基因的鑒定克隆，表達與殺蟲活性[J]. 農業生物技術學報，2009，17（5）：908-913.

[20]Swiecicka I，Bideshi D K，Federici B A. Novel isolate of Bacillus thuringiensis subsp. that produces a quasicuboidal crystal of Cry1Ab21 toxic to larvae of Trichoplusia ni[J]. Applied and Environmental Microbiology，2008，74（4）：923-930.

[21]Baig D N，Mehnaz S. Determination and distribution of cry-type genes in halophilc Bacillus thuringiensis isolates of Arabian Sea sedimentary rocks[J]. Microbiological Research，2010，165（5）：376-383.

[22]Guo S Y，Ye S，Liu Y F，et al. Crystal structure of Bacillus thuringiensis Cry8Ea1：an insecticidal toxin toxic to underground pests，the larvae of Holotrichia parallela[J]. Journal of Structural Biology，2009，168（2）：259-266.