1例手足口病重癥死亡病例的尸檢病理觀察

蘇佳 李懿 徐冰 趙嘉詠 許汴利 黃學勇

(河南省疾病預防控制中心 河南 鄭州 450016)

1例手足口病重癥死亡病例的尸檢病理觀察

蘇佳 李懿 徐冰 趙嘉詠 許汴利 黃學勇

(河南省疾病預防控制中心 河南 鄭州 450016)

目的觀察手足口病死亡病例組織器官病理變化，探討病理發生機制，為臨床診斷、治療和預防提供科學依據。方法采集手足口病死亡病例組織、胸腔積液和糞便等標本，實時熒光RT-PCR檢測胸腔積液和糞便標本中手足口病病原核酸，并進一步分離病毒，進行基因組測序和序列分析，并對組織標本進行HE染色病理學檢查。結果胸腔積液和糞便標本EV71病毒核酸檢測陽性，細胞培養分離到5株EV71毒株，基因型為C4基因亞型；病理組織學檢查發現肺、腎臟、胸髓和肝臟組織病理變化。結論EV71病毒感染是引起手足口病患者死亡的主要原因。

手足口病；死亡；EV71病毒；尸體解剖；組織病理

手足口病是一種常見的腸道傳染病，多發生于5歲以下的兒童，其主要臨床表現為發熱、口腔潰瘍及特征性出疹等輕型病例，部分病例出現循環系統、呼吸系統、神經系統等并發癥，發展為重癥病例，少數病情嚴重者甚至導致死亡，成為危害兒童健康的重要疾患之一[1]。目前臨床治療對手足口病主要以對癥治療為主，尚無有效的抗病毒藥物和疫苗接種預防控制措施，因此近年來中國許多地區疫情嚴重，成為長期流行趨勢。手足口病是根據患者的癥狀和部位命名的，由20多種(型)腸道病毒引起的急性傳染病，以腸道病毒7l型(EV71)和柯薩奇病毒A16(CA16)最為常見，其中EV71是引起當前我國手足口病的病原優勢株[2]。EV71病毒可經消化道、呼吸道傳播，傳染性和毒力強，感染引起的手足口病病情進展迅速，易合并呼吸系統和中樞神經系統疾病，是重癥手足口病的最主要致病病原體，對其病能力和致病機制還需進一步深入研究。本研究通過觀察EV71病毒感染引起的手足口病死亡病例組織器官病理變化，探討其病理發生機制，為臨床診療和預防提供科學依據。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑①儀器：全自動冰凍切片機(美國Thermo Fisher公司)，顯微鏡(日本Olympus 公司)，熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad 公司)。②試劑：病毒RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)， 手足口病實時熒光RT-PCR試劑盒(江蘇碩世生物科技有限公司)，逆轉錄試劑盒和PCR擴增試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。

1.2臨床資料患兒，女，1歲1個月，因發熱、腹脹、間斷嘔吐、抽泣樣呼吸、精神差3 d入院治療。病史：發熱，最高40.1 ℃；右足、臀部有紅色斑丘疹；精神差，易驚厥；嘔吐數次，呈噴射狀，嘔吐物為胃內容物，并伴腹脹；抽泣樣呼吸，在村診所按發熱嘔吐治療2 d，效果差。體檢發現患兒面色蒼白、口唇發紺，四肢末梢冰涼發紺，深昏迷；呼吸表淺不規則，30次/min，雙肺呼吸音粗，可聞及濕啰音；心率130次/min，律齊，心音低鈍；腹部膨隆，肝肋下4 cm可觸及，脾肋下未觸及，腸鳴音弱；頸強直，生理反射存在雙側巴氏征、布氏征、克氏征均陰性。臨床診斷為重癥手足口病、神經源性肺水腫、多臟器功能衰竭。立即器官插管、機械通氣等搶救措施；脫水、降顱壓、改善循環，激素沖擊等支持治療。在治療過程中患兒突發心率減慢、呼吸心跳驟停，緊急心肺復蘇、搶救無效死亡。

1.3尸體解剖與取材手足口病死亡病例按傳染病尸體解剖要求進行系統的病理解剖，記錄尸體各組織器官的大體形態改變，收集尸體心、 肝、 脾、 肺、 腎、腦等全部臟器和胸腔積液、糞便等標本，-80 ℃保存。

1.4標本處理和RNA提取取約2 g糞便標本于離心管中，加入10 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，2 g玻璃珠，1 ml氯仿，充分振蕩混勻。1 500 r/min，20 min離心后，取上清液140 μl，或胸腔積液140 μl，按病毒RNA提取試劑盒使用說明書進行操作提取病毒RNA。

1.5實時熒光RT-PCR方法檢測反應體系為20 μl：熒光RT-PCR反應液7.5 μl，酶混合液5 μl，腸道病毒通用型反應液或CA16型/EV71型雙重反應液4 μl，去RNA酶水3.5 μl，待測標本RNA 5 μl，充分混勻，6 000 r/min，離心10 s。熒光RT-PCR擴增程序：50 ℃逆轉錄30 min；95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火40 s，55 ℃延伸40 s，并采集熒光，45個循環；同時設立陽性、陰性對照，實驗檢測結束后存盤分析結果。陰陽性對照成立，Ct值≤35判為陽性。

1.6毒株分離培養與基因組測序將熒光RT-PCR檢測陽性標本接種于單層人橫紋肌肉瘤細胞(human rhabdomyosarcoma，RD)，置于36 ℃、5%CO2培養箱培養，連續培養7 d，每天觀察并記錄細胞病變，每份標本至少盲傳3代。若不出現致細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)，則判為陰性；若出現腸道病毒特異的CPE，待CPE達到+++以上收集細胞。對收集的病變細胞樣本，提取病毒RNA，使用逆轉錄試劑盒，合成cDNA，合成EV71全基因測序引物，RT-PCR擴增EV71基因組，擴增陽性產物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.7組織病理學檢查使用全自動冰凍切片機對死亡病例臟器標本冰凍切片，厚度為5～10 μm，將切片附貼在載玻片上，進行HE染色。冰凍切片60 ℃烤片2 h固定，梯度乙醇處理下行入水，入蘇木素染色液中染色15 min，流水洗去染液；采用1%鹽酸酒精分色，流水沖洗1～2 min以上，去除切片中的酸性物質，伊紅染色5 min；常規脫水、透明、封片，顯微鏡觀察各器官病變發生情況。

2 結果

2.1熒光定量RT-PCR檢測結果采集手足口病死亡病例胸腔積液和糞便標本共5份，其中胸腔積液標本2份，盲腸、結腸、直腸內份標本各1份。分別應用手足口病實時熒光RT-PCR試劑盒進行檢測，5份標本均EV71陽性。

2.2病毒分離與基因組序列同源性比較5份標本進行細胞培養和分離病毒，全部出現明顯CPE，分離到5株病毒毒株。通過手足口病實時熒光RT-PCR試劑盒進一步鑒定證實為EV71毒株。對其中1株EV71進行基因組擴增測序結果顯示，全基因組核苷酸長度為7 406 bp (毒株名稱：EV71/HENAN/DC/2010，Accession No. HQ325852.1)，與安徽、山東、福建、北京等EV71分離株核苷酸相似性為97.5%～98.5%，基因型同屬于C4基因亞型。

2.3病理組織學檢查結果手足口病死亡病例心、 肝、 脾和腎器官表面光滑，與0.1～1.5歲嬰幼兒正常器官相比，無明顯異常；腦表面光滑，但血管輕度擴張充血；雙肺表面光滑，暗紅色，擠壓有淡紅色泡沫狀液體流出。病理組織學檢查結果如下。①肺：肺泡間隔明顯增寬，肺泡間隔內毛細血管擴張充血出血，肺泡腔內可見少量紅細胞，個別呼吸性細支氣管周灶性淋巴細胞浸潤。見圖1。②腎臟：腎小管上皮細胞中度水樣變性，管腔內可見粉染漿液性滲出，腎小球充血，腎間質內大量血管擴張充血出血，尤其以髓質改變顯著。見圖2。③胸髓：蛛網膜下腔管周圍毛細血管擴張，血管周較多淋巴細胞浸潤，神經膠質內血管周水腫。見圖3。④肝臟：肝小葉結構正常，小葉內肝細胞索萎縮，肝竇擴增，個別肝細胞脂肪變性，門管區少量淋巴細胞浸潤。見圖4。

圖1 肺泡間隔內毛細血管擴張充血出血(×100)

圖2 腎間質內大量血管擴張充血出血(×100)

圖3 蛛網膜下腔管周圍毛細血管擴張， 其周圍有較多淋巴細胞浸潤(×100)

圖4 肝小葉結構正常，門管區少量淋巴細胞浸潤(×50)

3 討論

手足口病是多種腸道病毒引起的，主要病原體包括柯薩奇病毒A組16、4、5、7、9、10型，B組2、5型；埃可病毒和EV71，其中以EV71及CA16型最為常見[3-4]。近年來，中國手足口病報告病例數逐年增加，實驗室診斷病例中， EV71所占比例超過50%，該病病程短，進展快，易發展為重癥病例，少數病例出現死亡，其中超過90%的手足口病死亡病例由EV71感染導致[5-6]。本研究中，從手足口病死亡病例胸腔積液和糞便標本中檢測EV71陽性，證實該病例死亡是由EV71感染引起的，并進一步分離到毒株，基因組核苷酸比對分析，與近年來我國EV71分離株相似性為97.5%～98.5%，沒有發生較大變異。通過尸體解剖和病理學檢查可發現患兒肺、腎臟、胸髓和肝臟等器官出現病變，說明EV71對這些組織具有嚴重侵害作用，可導致病毒性肺炎、病毒性腦炎和免疫器官損害，甚至死亡。這與蒙國照等[7]研究結果相類似。

綜上所述，EV71病毒感染是引起手足口病患者死亡的主要原因，臨床應針對EV71病毒探索有效診療與預防該病的突破點，對提高其臨床預后有重大意義。

[1] 馬紅霞,潘靜靜,李懿,等.合并神經癥狀的手足口病病原學和流行病學特征[J].中華微生物學和免疫學雜志,2016,36(11):851-854.

[2] 鄭亞明,楊娟,廖巧紅.中國6月齡至5歲以下手足口病重癥病例直接醫療費用情況及其影響因素[J].中華預防醫學雜志,2017,51(1):87-92.

[3] Yan J J, Su I J, Chen P F,et al. Complete genome analysis of enterovirus 71 isolated from an outbreak in Taiwan and rapid identification of enterovirus 71 and coxsackievirus A16 by RT-PCR[J].J Med Virol,2001,65(2):331-339.

[4] Pérez-Vélez C M, Anderson M S, Robinson C C, et al. Outbreak of neurologic enterovirus type 71 disease: a diagnostic challenge[J].Clin Infect Dis,2007,45(8):950-957.

[5] 黃學勇,康鍇,許玉玲,等.2008—2011年河南省手足口病患兒病原學監測結果[J].中華預防醫學雜志,2012,46(10):883-887.

[6] 隋吉林,王子軍.635例手足口病死亡病例流行病學及臨床特征分析[J].中華流行病學雜志,2012,33(11):1201-1202.

[7] 蒙國照,李美瓊,李運千,等.危重型手足口病3例尸檢臨床病理分析[J].臨床與實驗病理學雜志,2011,27(1):48-51,55.

Postmortempathologyobservationonadeathcaseofseverehandfootandmouthdisease

Su Jia, Li Yi, Xu Bin, Zhao Jiayong, Xu Bianli, Huang Xueyong

(HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China)

ObjectiveTo explore the pathogenesis of hand foot and mouth disease by observing the pathological changes of tissues and organs of the death case of severe hand foot and mouth disease, so as to provide scientific basis for clinical diagnosis, treatment and prevention.MethodsTissue, pleural effusion and stool samples of the death case of severe hand foot and mouth disease were collected, and pathogenic nucleic acid was detected using real-time RT-PCR,followed by isolation of the virus, genome sequencing and sequence analysis, HE staining, pathological examination.ResultsEV71 virus nucleic acid in pleural effusion and stool samples was positive, and 5 strains of were isolated by cell culture, and the genotype was C4. The pathological changes of lung, kidney, thoracic spinal cord and liver were observed by histopathological examination.ConclusionEV71 infection is the leading cause of death in patients with hand foot and mouth disease.

hand foot and mouth disease; death; EV71 virus; autopsy; histopathology

R 361+.2

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.19.003

2016-12-25)

河南省科技創新杰出青年人才項目(164100510008)；河南省科技攻關計劃項目 (122102310268)；河南省醫學科技攻關計劃省部共建項目(201001015)。

黃學勇，E-mail：hxyzzu@163.com。