A型肉毒毒素對人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究

楊艷清++張潔++許其軍++吳希晞++黃燕++高揚(yáng)++江昌艷

[摘要]目的：探討A型肉毒毒素對人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響。方法：體外分離和培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入A型肉毒毒素（稀釋成5U/0.1ml）進(jìn)行干擾，空白對照組培養(yǎng)液中不加A型肉毒毒素。培養(yǎng)72h后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， MTT]法顯示A型肉毒毒素作用后細(xì)胞增殖速度變慢；流式細(xì)胞儀檢測顯示實(shí)驗(yàn)組早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量較空白對照組均明顯增多，成纖維細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：A型肉毒毒素可以抑制瘢痕疙瘩組織中成纖維細(xì)胞的增殖活性，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的凋亡。

[關(guān)鍵詞]A型肉毒毒素；瘢痕疙瘩；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞增殖；凋亡

[中圖分類號]R619+.6 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）09-0043-03

Effects of Botulinum Toxin Type A on Apoptosis of Human Keloid Fibroblast

YANG Yan-qing，ZHANG Jie，XU Qi-jun，WU Xi-xi，HUANG Yan，GAO Yang， JIANG Chang-yan

（Department of Plastic Surgery， Tongren Hospital of Wuhan University，Wuhan Third Hospital，Wuhan 430060，Hubei，China）

Abstract： Objective To investigate the effects of botulinum toxin type A （BTXA） on apoptosis of human keloid fibroblast. Methods Human keloid fibroblast was isolated and cultured in vitro， the medium containing BTXA（diluted concentration of 5U/0.1ml）was used to intervene the cell growth in experience group， BTXA was not added in blank control group. At 72 hours after cells were cultured， cells apoptosis were measured by flow cytometry（ FCM ）. Results Cells proliferation rate was slow with MTT method. The cell numbers of early and late apoptosis in experience group were significantly more than those of early and late apoptosis in blank control group with FCM， showing a significant difference between them（P<0.05）. Conclusion BTXA can inhibit the proliferation and induce apoptosis of human keloid fibroblast.

Key words： botulinum toxin type A； keloid； fibroblast； cell proliferation； apoptosis

瘢痕疙瘩屬于整形外科難治性疾病之一，對于較局限性的瘢痕疙瘩，瘢痕內(nèi)藥物注射是主要的治療方法，目前最常用的藥物是激素類藥物，但是注射后，可能發(fā)生不易被患者接受的不良反應(yīng)[1-2]。近年來，有研究表明A型肉毒毒素可治療和預(yù)防瘢痕疙瘩[3-6]，但作用機(jī)制還不是十分清楚[7-8]。筆者在體外培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的基礎(chǔ)上，研究了A型肉毒毒素對成纖維細(xì)胞凋亡的影響，以進(jìn)一步探索其治療瘢痕疙瘩的作用機(jī)制。

1 臨床資料

收集2015年6月-2016年12月在筆者科室行上臂瘢痕疙瘩切除的患者組織標(biāo)本29例，均為男性，年齡18～36歲，平均28.16歲。取材前6個(gè)月沒有藥物治療史，標(biāo)本的獲取征得患者本人同意。使用材料：A型肉毒毒素（衡力；蘭州生物制品研究所）。

2 方法

2.1 人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：手術(shù)臺獲取29例患者上臂瘢痕疙瘩組織標(biāo)本，磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）反復(fù)浸泡沖洗，加入1ml 0.25%胰酶，4℃過夜。次日分離表皮和真皮，將組織塊剪碎成小放入離心管中，加入組織量2倍的0.2%IV型膠原酶，37℃消化。向離心管中加入2ml PBS，吹打組織塊，過200目篩網(wǎng)，制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液離心后棄上清，加入4ml含雙抗的10%胎牛血清重懸細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)并以2×106/ml細(xì)胞量接種于培養(yǎng)瓶中，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中25min，PBS反復(fù)沖洗2次，盡量去除未貼壁細(xì)胞，以純化細(xì)胞。更換含雙抗的10%胎牛血清4ml，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液，以后每2～3d換液一次。

2.2 MTT法繪制細(xì)胞生長曲線：收集第4代成纖維細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組和空白對照組。實(shí)驗(yàn)組加入含A型肉毒毒素5U/0.1ml（臨床常規(guī)濃度范圍）的1%胎牛血清DMEM，空白對照組培養(yǎng)液中不加A型肉毒毒素。以1×104/孔的濃度接種細(xì)胞于96孔板，96孔板每一行設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白組1孔（僅加入培養(yǎng)基）以作為細(xì)胞孔的調(diào)零對照。每天在相同的時(shí)間點(diǎn)取孔板的一行進(jìn)行檢測，連續(xù)8d。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制出兩組細(xì)胞的生長曲線。

2.3 觀察肉毒毒素對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響：收集第4代成纖維細(xì)胞，分成6組，實(shí)驗(yàn)組和空白對照組各3組。實(shí)驗(yàn)組加入含A型肉毒毒素5U/0.1ml的1%胎牛血清DMEM，空白對照組培養(yǎng)液中不加A型肉毒毒素。72h后流式細(xì)胞儀檢測，觀察細(xì)胞凋亡情況：六孔板中的細(xì)胞用PBS洗滌一次，加入1ml 0.25%胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓且有部分細(xì)胞懸浮時(shí)加入PBS終止消化。用移液槍輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮。收集于流式管中，離心、棄上清。加入3ml 4℃預(yù)冷的PBS完全重懸細(xì)胞，1 500r/min離心5min，棄上清，沉淀用300μl的Binding Buffer重懸。加入5μl Annexin V-FITC混勻后，再加入5μl Propidium Iodide混勻。室溫下避光反應(yīng)5min。于1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間的細(xì)胞光密度值比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，兩組間細(xì)胞凋亡率比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 A型肉毒毒素對成纖維細(xì)胞增殖能力的影響：成纖維細(xì)胞的生長曲線均呈上升“S”形，有明顯的潛伏期、指數(shù)增殖期和平臺期，符合細(xì)胞生物學(xué)的生長規(guī)律。空白對照組第3天開始進(jìn)入對數(shù)增長期，實(shí)驗(yàn)組第5天開始進(jìn)入對數(shù)增長期（圖1）。從指數(shù)增殖期開始，相同時(shí)間點(diǎn)測得兩組細(xì)胞的光密度值（OD值），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3.2 A型肉毒毒素對成纖維細(xì)胞凋亡的影響：從流式散點(diǎn)圖可知，加入A型肉毒毒素作用于成纖維細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞較空白對照組均明顯增多（圖2）。通過χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與空白對照組樣本比較，成纖維細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

4 討論

瘢痕疙瘩是良性皮膚纖維組織的增生性病變，其中成纖維細(xì)胞的過度增殖是瘢痕疙瘩的主要病理組織學(xué)特征之一[9]。成纖維細(xì)胞凋亡在創(chuàng)傷后組織修復(fù)過程中具有重要影響，細(xì)胞凋亡與瘢痕疙瘩的形成也有密切關(guān)系[10-11]。A型肉毒毒素作為有效預(yù)防和治療瘢痕疙瘩的可能方法，其對瘢痕疙瘩組織中成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡的影響還有待于深入研究，這有助于進(jìn)一步闡明肉毒毒素治療瘢痕疙瘩的作用機(jī)制。

為了觀察A型肉毒毒素對成纖維細(xì)胞的影響，筆者通過獲取人瘢痕疙瘩組織標(biāo)本，在體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，然后加入A型肉毒毒素作用于成纖維細(xì)胞。應(yīng)用MTT法繪制成纖維細(xì)胞的生長曲線可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞指數(shù)增殖期延遲，而且進(jìn)入平臺期細(xì)胞的OD值顯著低于空白對照組的細(xì)胞OD值，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明A型肉毒毒素對成纖維細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，這可能是肉毒毒素對瘢痕疙瘩發(fā)揮治療作用的原因之一。進(jìn)一步運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，A型肉毒毒素作用后，成纖維細(xì)胞的早期和晚期凋亡率較空白對照組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明A型肉毒毒素可以一定程度地誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的凋亡，也提示其對瘢痕疙瘩的治療作用可能是通過促使成纖維細(xì)胞凋亡，減少膠原分泌來實(shí)現(xiàn)的。

本研究表明，A型肉毒毒素既可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖，又能促進(jìn)其凋亡，進(jìn)而達(dá)到治療瘢痕疙瘩的目的。但是在臨床治療中，有關(guān)A型肉毒毒素使用的濃度和劑量，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。本研究中參考國內(nèi)臨床使用A型肉毒毒素常用的劑量方案[14-15]，按照50U/1ml的濃度來配置，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)研究得出了上述結(jié)論。為了達(dá)到更優(yōu)化的治療效果，還需要在臨床工作中探索出比較合理的A型肉毒毒素藥物配置的濃度和注射劑量。

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[收稿日期]2017-03-10 [修回日期]2017-07-21

編輯/張惠娟