無創性延遲肢體缺血預適應對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

趙會穎，楊永剛，張建平，李貴琴，錢玉中，李倩倩

(1.河北省石家莊市第一醫院老年病科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第一醫院中醫科，河北 石家莊 050011)

·論著·

無創性延遲肢體缺血預適應對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

趙會穎1，楊永剛1，張建平1，李貴琴1，錢玉中2，李倩倩1

(1.河北省石家莊市第一醫院老年病科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第一醫院中醫科，河北 石家莊 050011)

目的觀察無創性肢體缺血預適應(noninvasive delayed limbischemic preconditioning，NDLIP)對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。方法將30只健康雄性SD大鼠隨機分成假手術組、缺血再灌注組和NDLIP組各10只。NDLIP組大鼠給予左側后肢缺血5 min、再灌注5 min，每天1次，連續操作3 d，然后再制作缺血模型；假手術組大鼠給予同樣的麻醉和操作，但不進行頸總動脈的閉塞；假手術組和缺血再灌注組不進行NDLIP操作。檢測各組大鼠海馬超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平。結果缺血再灌注組和NDLIP組大鼠海馬MDA含量明顯高于假手術組，SOD含量明顯低于假手術組，Bax、Caspase-3表達水平明顯高于假手術組，Bcl-2表達水平明顯低于假手術組；NDLIP組大鼠海馬MDA含量明顯低于缺血再灌注組，SOD含量明顯高于缺血再灌注組，Bax、Caspase-3表達水平明顯低于缺血再灌注組，Bcl-2 的表達水平明顯高于缺血再灌注組。結論NDLIP能顯著減少腦缺血再灌注損傷后凋亡的發生和氧化應激損傷，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

腦缺血；再灌注損傷；肢體遠端缺血預適應；大鼠

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.11.002

腦缺血正逐漸成為世界范圍內發病率和病死率的主要原因，主要病理生理表現是急性腦缺血-再灌注損傷[1]。許多關于中風的藥理學神經保護策略的臨床試驗均令人失望，目前缺血性腦血管病的治療方法是腦保護治療和超早期靜脈溶栓治療[2]。肢體缺血預適應是指肢體短暫缺血后，肢體自身的肌肉或遠隔部位的組織器官可以耐受較長時間的缺血損傷。由于肢體缺血預適應可通過對機體相對不太重要的器官進行預適應，從而達到保護機體重要器官的作用(如心臟、腦等)，因此其具備很好的臨床應用價值，已經逐漸成為目前研究的熱點。筆者采用無創性肢體缺血預適應(noninvasive delayed limbischemic preconditioning，NDLIP)的方法對大鼠缺血再灌注模型進行研究，旨在探討其對大鼠腦再灌注損傷的保護作用及其相關機制。現報告如下。

1 材 料 與 方 法

1.1 實驗動物及實驗試劑 健康SPF級雄性SD大鼠30只，體質量240～280 g，由河北省實驗動物中心提供。動物飼養室室溫調節在22～25 ℃，給予動物12 h光照和12 h黑暗環境。主要試劑：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(美國abcam公司)，β-actin抗體、Bax、Bcl-2及Caspase-3抗體(美國abcam公司)。大鼠分為假手術組、缺血再灌注組和NDLIP組各10只。

1.2 模型制作 NDLIP組大鼠麻醉后，以無創血壓儀自制套管置于大鼠左后肢根部，加壓，以脈搏消失、皮膚發紺、肢體遠端皮溫下降為缺血的依據；減壓，以肢體遠端皮溫上升、脈搏出現、皮膚紅潤為再灌注的依據；給予左側后肢缺血5 min、再灌注5 min，每天1次，連續操作3 d，然后再制作缺血模型。假手術組大鼠給予同樣的麻醉和操作，但不進行頸總動脈的閉塞。假手術組和缺血再灌注組不進行NDLIP操作。

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑盒檢測SOD和 MDA含量 各組取5只大鼠缺血再灌注24 h后斷頭取腦，分離大鼠海馬組織，應用SOD和MDA試劑盒檢測各組大鼠海馬SOD和MDA的表達情況。

1.3.2 Western blot檢測大鼠海馬Bax、Bcl-2及 Caspase-3的表達 各組取5只大鼠麻醉后快速斷頭取腦，分離海馬組織、提取蛋白。海馬組織使用RIPA組織裂解液進行裂解(冰上30 min)，4 ℃條件下，應用離心機(16 000 r/min)將勻漿進行離心30 min，提取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。將樣本加入每個泳道，應用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，室溫下進行電泳(3 h)，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上(4 ℃、電壓100 V)。放入5%脫脂牛奶的緩沖液中處理1 h。與下列抗體孵育(4 ℃ 過夜)：抗Bax抗體(1∶1 000)、抗Bcl-2抗體(1∶1 000)、抗Caspase-3抗體(1∶2 000)、β-actin抗體 (1∶2 000)。洗膜，室溫暗室環境下與二抗孵育結合1 h。然后應用紅外成像系統掃摸。每個目的蛋白的光密度值/β-actin 光密度值得出的比值為各目的蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法 應用SPSS 18.0統計學軟件分析數據，計量資料比較分別采用單因素方差分析和q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠海馬MDA和SOD含量比較 缺血再灌注組和NDLIP組大鼠海馬MDA含量明顯高于假手術組，SOD含量明顯低于假手術組(P<0.05)；NDLIP組大鼠海馬MDA 的含量明顯低于缺血再灌注組，SOD含量明顯高于缺血再灌注組(P<0.05)。見表1。

組別 MDA(nmol/mg)SOD(U/mg)假手術組 0．74±0．199．02±1．08缺血再灌注組1．55±0．28?3．54±0．76?NDLIP組 1．13±0．16?#6．85±0．69?#F 97．357124．531P 0．0000．000

*P<0.05與假手術組比較 #P<0.05 與缺血再灌注組比較(q檢驗)

2.2 各組大鼠海馬Bax、Bcl-2及Caspase-3表達水平比較 缺血再灌注組和NDLIP組大鼠海馬Bax、Caspase-3表達水平明顯高于假手術組，Bcl-2表達水平明顯低于假手術組(P<0.05)；NDLIP組大鼠海馬Bax、Caspase-3表達水平明顯低于缺血再灌注組，Bcl-2表達水平明顯高于缺血再灌注組(P<0.05)。見表2，圖1。

組別 BaxBcl?2Caspase?3假手術組 0．187±0．0260．703±0．1330．096±0．015缺血再灌注組0．648±0．157?0．246±0．039?0．462±0．068?NDLIP組 0．425±0．161?#0．534±0．064?#0．219±0．035?#F 89．573107．249156．372P 0．0000．0000．000

*P<0.05與假手術組比較 #P<0.05與缺血再灌注組比較(q檢驗)

圖1各組大鼠海馬Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達
Figure1TheproteinexpressionofBax,Bcl-2andCaspase-3indifferentgroups

3 討 論

腦灌注全面或局灶性減少導致的腦缺血損傷是全世界范圍內殘疾和死亡發生的最常見和重要的原因。這些患者可能會遭受各種各樣的難題，如運動障礙、感覺障礙、記憶障礙以及缺血性損傷導致的許多情緒和社會問題[3]。到目前為止，大多數癥狀并不能得到有效治療。目前，急性缺血性腦損傷患者的神經保護或腦修復治療并不能滿足臨床需求。藥物治療的效果也不盡如人意。因此，大腦保護機體自身免受有害刺激并從損傷中修復的內源性機制正在成為研究的熱點。

缺血預適應為誘導內源性的神經保護作用提供了一種有效的方式。缺血預適應的概念最早是由Murry等[4]于1986年在缺血性心臟病模型中描述的。除了對心肌的保護作用，在肝臟、腎臟和大腦中，同樣可以發現缺血預適應發揮對抗急性缺血再灌注損傷的現象[5-6]。通過動物實驗發現反復的、短暫的、非致命性的缺血再灌注可使機體產生一系列內源性物質，可減小梗死面積，有效對抗持續致命性的腦缺血和再灌注損傷，被認為是一種強有力的內源性保護機制。但是，到目前為止，缺血預適應發揮神經保護的神經生物學機制仍然不是十分明確。

凋亡是一種程序化的死亡方式，以一系列明確的細胞形態和生物學改變為特征。大腦缺血后通過多種死亡信號通路激活凋亡的發生，尤其是Caspase的激活[7-8]。Caspases或半胱氨酸依賴性、天冬氨酸調控性蛋白酶，是一組在細胞凋亡中起重要作用的半胱氨酸蛋白酶[9]。研究者將Caspases定義為“劊子手”蛋白質，說明了其重要地位。有2種類型的凋亡相關Caspases酶：觸發劑(頂端)Caspases和效應器(劊子手)Caspases酶。Caspase-9屬于觸發劑Caspases，而Caspase-3和Caspase-6屬于效應器Caspases酶。Caspase-3可以促使DNA出現片段化，進而激活內切酶并分裂核DNA，最終引起細胞死亡，在線粒體調節的凋亡過程中起到了至關重要的作用。因此，Caspase-3促進凋亡發生[10]，通過對Caspase-3的抑制作用能有效抑制凋亡的進程。Bcl-2家族的蛋白質位于線粒體外膜，調控著下游Caspases的激活，故在線粒體調控的凋亡途徑中扮演著關鍵的細胞內關卡作用[11-13]。Bcl-2家族主要包括Bcl-2和Bax，它們在功能上是截然相反的：Bcl-2是重要的凋亡抑制蛋白，Bax促進凋亡的發生[14-15]。本研究采用免疫印記方法檢測Bax、Bcl-2及Caspase-3的表達，結果發現NDLIP下調海馬Caspase-3和Bax的表達，但上調了海馬Bcl-2的表達。表明NDLIP具有明顯的抗凋亡特性。

MDA和SOD是與氧化應激密切相關的指標。MDA是氧化應激時脂質出現過氧化反應的產物，MDA與氧化應激的程度呈正相關[16]，可視為與氧化應激損傷密切相關的代表性標志物。氧化應激損傷會損害抗氧化防御系統，影響抗氧化物酶的表達[17]。大腦缺血再灌注損傷與氧化應激損傷密切相關[18-20]。缺血再灌注后腦組織產生大量的氧自由基，影響細胞膜中磷脂的多聚不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化反應，產生大量的脂質過氧化物和自由基，導致腦組織細胞功能和(或)結構的變化。本研究結果顯示，缺血再灌注組大鼠海馬MDA含量明顯高于假手術組，SOD的活性明顯降低于假手術組，NDLIP組大鼠海馬MDA的含量明顯低于缺血再灌注組，SOD含量明顯高于缺血再灌注組。表明NDLIP能夠有效地減少缺血再灌注后大鼠腦中氧自由基的損傷，增強大腦的抗氧化應激能力，這可能是NDLIP對大腦產生保護作用的生物學機制之一。

總之，缺血或缺氧預適應的調節機制是一個復雜的細胞調控過程，包括多重細胞信號通路，從而增強機體對缺血、缺氧的耐受性。到目前為止，有許多機制可能與缺血損傷的調節作用有關，尤其是在冠心病方面。已經發現多種關鍵分子和信號傳導途徑，包括GABA受體、誘導型一氧化氮合成酶、腺苷、熱休克蛋白等。可以肯定的是，腦缺血耐受可以保護神經元，還能有效維持大腦功能。但是，關于這種類型的調節或交叉耐受性之間的關系，所涉及的研究很少。今后將進一步研究各種調節方法的共同機制，從而能夠從藥理學上開發其保護作用。

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Theprotectiveeffectofnoninvasivedelayedlimbischemicpreconditioningoncerebralischemiareperfusioninjuryinrats

ZHAO Hui-ying1, YANG Yong-gang1, ZHANG Jian-ping1, LI Gui-qin1, QIAN Yu-zhong2, LI Qian-qian1

(1.DepartmentofGeriatricsandGerontology,theFirstHospitalofShijiazhuangCity,HebeiProvince，Shijiazhuang050011,China; 2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,theFirstHospitalofShijiazhuangCity,HebeiProvince，Shijiazhuang050011,China)

]ObjectiveTo study the protective effect of noninvasive delayed limb ischemia preconditioning(NDLIP) on cerebral ischemia reperfusion injury in rats.MethodsThirty healthy male SD rats randomly divided into 3 groups, Sham-operated group, ischemic-reperfusion group and NDLIP group(n=10/group). Rats in NDLIP group were subjected to 5 minutes ischemia/5 minutes reperfusion on the left hind limb once a day for 3 consecutive days, then all rats were subjected to cerebral ischemia reperfusion injury. The Sham-operated group gave the same anesthesia and operation, but did not carry out the occlusion of the common carotid artery. The sham-operated group and ischemic-reperfusion group were not performed NDLIP operation. The expression of superoxide dismutase(SOD) and malondialdehyde(MDA) was detected by the kit. The protein expression of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 were detected by Western blotting.ResultsCompared with the rats in the Sham-operation group, the contents of the hippocampal MDA, Bax and Casaspe-3 were significantly higher in the ischemic-reperfusion group. Compared with the rats in the ischemic-reperfusion group, the contents of the hippocampal MDA, Bax and Casaspe-3 were significantly decreased in the NDLIP group. Compared with the rats in the Sham-operation group, the contents of the hippocampal SOD and Bcl-2 were significantly decreased in the ischemic-reperfusion group. Compared with the rats in the ischemic-reperfusion group, the contents of the hippocampal SOD and Bcl-2 were significantly increased in the NDLIP group.ConclusionNDLIP could significantly reduce the occurrence of apoptosis and oxidative stress damage after cerebral ischemia reperfusion injury, it has protective effect on cerebral ischemia reperfusion injury.

brain ischemia; reperfusion injury； limb ischemia preconditioning; rats

2017-09-19；

2017-09-30

河北省科技計劃項目(15277785D)

趙會穎(1964-)，女，天津人，河北省石家莊市第一醫院主任醫師，醫學碩士，從事老年病診治研究。

R743.31

A

1007-3205(2017)11-1244-04

(本文編輯：趙麗潔)