氣相色譜法測定豬凝血酶凍干粉中磷酸三丁酯殘留量

劉璐+趙瑩瑩+張軍東

摘 要 建立了氣相色譜法測定豬凝血酶中磷酸三丁酯殘留量，并進行了方法學驗證。采用聚乙二醇毛細管柱Agilent HP-INNOWAX（30 m × 250 mm × 0.25 mm），溶劑為正己烷；氣化室溫度190 ℃，分流比1∶1，進樣量1 ml；FID檢測器溫度210 ℃；載氣為高純氮氣，流速為3 ml/min；柱溫150 ℃，運行時間13 min。結果顯示該方法專屬性強；標準曲線的線性范圍為2.406～19.25 mg/ml；低、中、高3個濃度水平的平均回收率分別為97.1%、101.1%和98.2%，總平均回收率為99.8%，總相對標準偏差為2.37%；中間精密度總標準偏差為5.01%；檢測限為0.762 mg/ml，定量限為2.54 mg/ml；3批樣品的磷酸三丁酯殘留量均低于《中華人民共和國藥典》2015年版三部的限量要求（<10 mg/ml）。該方法專屬性強、準確度、精密度、穩定性、耐用性良好，可用于豬凝血酶凍干粉中磷酸三丁酯殘留檢測。

關鍵詞 氣相色譜 豬凝血酶 磷酸三丁酯 殘留

中圖分類號：O657.71； R926 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）21-0076-05

Determination of the residual tri-n-butyl phosphate in porcine thrombin by gas chromatography

LIU Lu*， ZHAO Yingying， ZHANG Jundong

（Shanghai Haohai Biological Technology Co.， Ltd， Shanghai 200052， China）

ABSTRACT A gas chromatography method was established to determine the residual Tri-n-butyl phosphate in porcine thrombin and was completely evaluated. An Agilent HP-INNOWAX column （30 m×250 mm×0.25 mm） was adopted and the operation procedures were as follows： vaporizing chamber temperature 190 ℃， split ratio 1：1， sample volume 1 ml； FID detector temperature 210 ℃； carrier gas： highly pure nitrogen at 3 ml/min； column temperature 150 ℃ and running for13 min. The results showed that the method had strong specificity and the standard curve was linear over the range of 2.406～19.246 mg/ml. The average recoveries at low， medium and high levels were 97.1%， 101.1% and 98.2%， respectively and the overall average recovery was 99.8%， and the overall RSD value was 2.37% and RSD value of the mid-precision was 5.01%. The limit of detection was 0.762 mg/ml and the limit of quantitation was 2.54 mg/ml. The residual TNBP values from three batches of porcine thrombin were apparently lower than the limit value set by Chinese Pharmacopoeia （<10 mg/ml）. The method was suitable for the determination of residual TNBP in porcine thrombin with good accuracy， reproducibility， stability and robustness.

KEy WORDS gas chromatography； porcine thrombin； tri-n-butyl phosphate； residue

豬源纖維蛋白黏合劑（含豬纖維蛋白原、豬凝血酶及相應的溶解液）原為Ⅲ類醫療器械，臨床主要用于術中輔助止血。國家食品藥品監督管理總局2006年發布《關于規范纖維蛋白膠類產品監督管理有關事宜的公告》要求豬源纖維蛋白粘合劑類產品由醫療器械升級為藥品管理[1]。為提高產品臨床使用的安全性，本公司參照《血液制品去除/滅活病毒技術方法及驗證指導原則》[2]在豬凝血酶生產過程中采用有機溶劑/去污劑（S/D）處理法進行病毒滅活，其中有機溶劑為磷酸三丁酯（tri-n-butyl phosphate，TNBP），研究表明TNBP對包膜病毒具有較好的滅活效果[3-4]，但對人體有一定的毒性[5]，故按《中華人民共和國藥典》2015年版三部規定，磷酸三丁酯殘留量應不高于10 mg/ml[6]。本研究采用氣相色譜法對本公司生產的豬凝血酶進行TNBP殘留檢測，并對方法進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

豬凝血酶凍干粉（2.5 ml規格，批號：20161211、20170114、20170301）由本公司生產。endprint

磷酸三丁酯（GC，純度>99.9%，批號：BCBN5037V）購自上海凌峰化學試劑有限公司；磷酸三丙酯（GC，純度>99%，批號：38196TJV）購自美國Sigma-Aldrich公司；正己烷（HPLC，批號：68977223）購自上海邁瑞爾化學技術有限公司；高氯酸（AR，批號：20141025）購自永華化學科技（江蘇）有限公司；水為純化水。

1.2 主要儀器

安捷倫7890B氣相色譜儀含氫火焰離子化檢測器（FID）（美國安捷倫科技有限公司）；ME104型電子天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司）；H1650型高速臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；DKS24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.3 溶液配制

高氯酸溶液（1.5 mol/L）：量取70%高氯酸溶液12 ml加入裝有約80 ml超純水的100 ml量瓶中，待其溫度降至室溫后，加超純水定容至刻度并混勻。

內標溶液：精密稱取磷酸三丙酯0.25 g，加正己烷定容至25 ml，即為內標儲備液（10 mg/ml）。臨用前取內標儲備液0.50 ml于25 ml量瓶中，用正己烷定容即得內標溶液（200 mg/ml）。

對照品溶液（STD）：精密稱取磷酸三丁酯0.25 g，加正己烷定容至25 ml，即為對照品母液（10 mg/ml）。臨用前取對照品母液0.75 ml于25 ml量瓶中，用正己烷定容即得對照品溶液（300 mg/ml）。

樣品溶液：每瓶豬凝血酶凍干粉加2.5 ml純化水，待其完全溶解后，即得樣品溶液。

1.4 樣品處理

精密量取樣品溶液1.25 ml于玻璃離心管中，精密加內標溶液50 ml和1.5 mol/L高氯酸溶液0.375 ml，混勻，置37 ℃水浴保溫10 min后，加入正己烷2 ml，混勻，靜置10 min，3 000 r/min離心20 min，吸取上層清液進樣。

1.5 氣相色譜條件

聚乙二醇毛細管柱Agilent HP-INNOWAX（30 m ×250 mm × 0.25 mm）；溶劑為正己烷；氣化室溫度190 ℃，分流比1∶1，進樣量1 ml；FID檢測器溫度210 ℃；載氣為高純氮氣，流速為3 ml/min；柱溫150 ℃，運行時間13 min。

1.6 方法驗證

1.6.1 專屬性驗證

分別取適量內標（磷酸三丙酯）和對照品（磷酸三丁酯）用正己烷配制成濃度為5.0 mg/ml的內標溶液和對照品溶液，按1.5項進樣分析，考察方法的專屬性。

1.6.2 線性范圍確定

精密量取對照品溶液10、20、40、60、80 ml（25%、50%、100%、150%、200%水平），分別置已加1.25 ml水的離心管中，再向各對照品管精密加入內標溶液50 ml，混勻，置于37 ℃水浴保溫10 min后，放冷，再加入正己烷2 ml，混勻，靜置10 min后，3 000 r/min離心20 min，吸取上層清液，分別進樣上述溶液各一次。以對照品磷酸三丁酯濃度為x軸，以磷酸三丁酯和內標物峰面積之比（As/Ai）為y軸，進行線性回歸。

1.6.3 檢測限與定量限確定

檢測限確定：精密量取對照品母液3 ml置10 ml容量瓶中，正己烷定容至刻度，搖勻，再精密量取該溶液10 ml于加有1.25 ml水的離心管中，再加入50 ml的內標儲備液，混勻，置于37 ℃水浴保溫10 min后，放冷，再加入正己烷2 ml，混勻，靜置10 min后，3 000 r/min離心20 min，小心吸取上層正己烷層即得檢測限樣品，按1.5項進樣檢測。

定量限確定：精密量取對照品母液10.0 ml于加有1.25 ml水的離心管中，再加入50 ml的內標儲備液，混勻，置于37 ℃水浴保溫10 min后，放冷，再加入正己烷2 ml，混勻，靜置10 min后，3 000 r/min離心20 min，小心吸取上層正己烷層即得定量限樣品，按1.5項進樣檢測。

1.6.4 準確度、精密度（中間精密度）、穩定性試驗

準確度驗證：分別取對照品母液20、40 和60 ml于加有1.25 ml樣品溶液的離心管中，按1.4項樣品處理后即得濃度水平為50%、100%、125%的準確度樣品溶液，每一濃度水平平行配制3份，進樣檢測。

精密度驗證：采用準確度實驗數據作為操作人員甲的精密度（中間精密度）數據，操作人員乙在不同的日期、使用不同色譜柱、不同的系列溶液，平行配制6份100%水平準確度樣品以及2份控制樣品溶液，進樣檢測。

穩定性試驗：取對照品溶液和樣品溶液（100%水平準確度樣品），分別放置在室溫條件0、12、24和48 h，進樣檢測考察溶液穩定性。

1.6.5 耐用性試驗

在其他色譜條件不變的條件下，方法發生微小變動，分別調整離心轉速至方法規定的±200 r/min、調整載氣流速至方法規定的±0.2 ml/min、調整柱溫至方法規定的±2 ℃，考察其系統適應性。

2 結果

2.1 系統適用性

分別取空白溶劑和對照品溶液（STD）注入氣相色譜儀中分析。結果表明對照溶液（STD）中理論板數按磷酸三丁酯峰計算均高于5 000；磷酸三丁酯峰與內標峰的分離度均大于1.5；起始5針對照溶液（STD）中磷酸三丁酯與內標峰面積比的RSD均≤5.0%。所有間插進樣的對照品溶液中磷酸三丁酯與內標物峰面積之比與起始5針對照品溶液的平均峰面積的比值在95.99%～102.7%之間。

2.2 專屬性試驗

正己烷對內標物和對照品的保留時間沒有干擾，專屬性結果符合接受標準（圖1）。endprint

2.3 線性試驗

線性方程為y = 0.137 4x + 0.015 4，線性范圍為2.406～19.25 mg/ml，相關系數r = 0.999 7，符合接受標準（≥0.990）。

2.4 檢測限與定量限確定

檢測限樣品測得的信噪比（S/N）為5.2，滿足接受標準（S/N≥3），該方法的檢測限為0. 762 mg/ml。定量限樣品6次測得的信噪比（S/N）為15.2～16.8，6份樣品中主成分含量測定結果的RSD（n=6）為3.56%，滿足接受標準（S/N≥10，RSD 5.0%），該方法的定量限為2.54 mg/ml（表 1）。

2.5 準確度、精密度（中間精密度）、穩定性試驗

不同濃度準確度樣品測得主成分總平均回收率為99.8%，RSD為2.37%（表2）。

精密度樣品檢測結果顯示兩位操作人員制備的樣品中主成分回收率測定結果的RSD為5.01%（n=18），結果滿足接受標準（15.00%）（表3）。

穩定性試驗樣品檢測結果顯示對照品溶液和樣品溶液在不同時間內回收率比值均在 95.0%～105.0%之間（表4）。

2.6 耐用性試驗

正常方法與改變參數方法所得回收率之比應在95.0%～105.0%之間。結果顯示方法發生微小變動后主成分回收率在95.9%～100.9%（表5）。

2.7 樣品檢測

取3批豬凝血酶樣品（20161211、20170114、20170301）按1.4項進行樣品處理，進樣測定磷酸三丁酯殘留量，檢測結果分別為0.97、1.46和1.32 mg/ml，均小于方法的定量限（2.54 mg/ml），明顯低于《中華人民共和國藥典》2015年版三部規定不高于10 mg/ml，磷酸三丁酯殘留量合格。

3 討論

本法所用樣品為每瓶豬凝血酶凍干粉加2.5 ml純化水溶解后所得溶液。因樣品處理步驟較多、用量較大易導致揮發損失，從而引起較大誤差，因此將樣品取用量減至1.25 ml，同時將對照品、內標的濃度減半，將高氯酸溶液、正己烷和純化水的體積相應減半，使實驗結果更為準確可靠。

氣相色譜法已用于多種生物制品中磷酸三丁酯殘留量檢測[5-10]。在樣品處理過程中存在一定的乳化現象，且離心難以完全消除[5，8]，為使樣品離心更完全，本法將樣品混勻后靜置10 min再進行離心，有效降低了乳化可能導致對檢測的不利影響，提高了檢測結果的準確性。

在樣品處理過程中，藥典方法[6]以及多項研究[5，9]均采用吸取上層正己烷，用氮吹儀吹掃濃縮再取樣檢測的方法，不僅過程繁瑣且過程難以控制。本研究將空氣流濃縮步驟省略，改為增加進樣量直接進樣，可簡化實驗步驟而不影響實驗結果。同時本法參考藥典方法并根據實際情況對色譜條件做了相應調整，以得到更好的峰形和分離度。

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