基質輔助激光解析電離

楊輝

【摘 要】目的探究基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀在臨床微生物鑒定中的應用，為真菌微生物的鑒定提供臨床技術支持。方法選取于2015年3月到2017年2月我院臨床采集的真菌作為實驗標本，利用基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀對菌種進行鑒定，分析基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀對菌種鑒定的檢查效果。結果300株真菌中有290株（96.67%）經鑒定后可以正確歸類到種水平，6株（2%）未能給出鑒定成果，4株（1.33%）鑒定結果出現錯誤，且正確率與傳統方法相比差異顯著，具有統計學意義（P<0.05）。結論基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀穩定性高，可重復性好，并且具有快速準確的優點，是臨床鑒定微生物種類的一種快速可靠的高通量方法，可以為臨床的微生物鑒定提供一定的技術支持。

【關鍵詞】基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀；微生物鑒定；臨床應用

真菌感染是指由于機體感染真菌而引起的一系列疾病，感染類型大致包括表面感染，皮膚感染，皮下組織感染，深部感染以及條件性感染[1-4]。發生真菌感染的原因有很多，主要包括以下五個方面：（1）濫用抗生素：隨著光譜抗生素的廣泛應用，越來越多的人們選擇利用抗生素來治療細菌感染，這些抗生素在治療感染的同時也會減少有益菌的數量，從而破壞機體菌種平衡。（2）糖皮質激素的過量使用：針對炎癥患者以及皮膚病患者糖皮質激素的使用是必不可少的，然而這些藥物的使用卻會導致人體的免疫系統功能下降，為真菌感染創造了有利條件。（3）遺傳因素：遺傳因素也是機體產生真菌感染的一個重要原因，相對于正常人，這類人群由于遺傳物質的差異性導致他們更容易受到真菌的侵襲。（4）免疫系統功能障礙：由于化療或者免疫系統缺陷癥等因素導致機體免疫系統功能發生障礙，從而給真菌染感染創造了一個適宜生長的環境[5-9]。因此真菌感染在臨床上也越來越多見。常見的實驗室真菌鑒定方法是常規傳統真菌鑒定方法，這種方法操作復雜，鑒定周期較長，對于設備以及技術水平的要求較高，因此往往會造成臨床診斷以及治療的滯后性，會廣大醫患人員帶來較大的困擾，然而隨著科學技術的不斷進步，基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術出現在人們視野之中。基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術是一種快速鑒定微生物種類的新技術，近年來廣泛應用于醫學、生物等多個領域[10]。因此本次研究通過比較傳統真菌鑒定方法與基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術對菌種鑒定的準確率，探究基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀在臨床微生物鑒定上的應用。

1 資料與方法

1.1 菌種來源

本次研究一共選取300株真菌作為研究對象，全部菌株均來自于2015年3月到2017年2月我院臨床采集的真菌，質控菌種為白念珠菌ATCC14053和大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 試驗儀器與設備

法國梅里埃公司的基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀以及配套的數據庫系統，電子顯微鏡，水浴鍋，無菌注射器，基質液，一次性無菌試管，全自動微生物鑒定儀，真菌培養箱，離心機，移液槍等。

1.3 實驗方法

對采集來的真菌標本進行分離培養，標本接種在平板上在36℃的真菌培養箱中進行培養，直到肉眼可見菌落時進行細菌種類鑒定。對所有菌種同時采用兩種方法進行鑒定，分別為常規傳統真菌鑒定方法以及基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術，對比兩種結果準確率。常規真菌鑒定方法是將菌落進行革蘭氏染色，同時對菌落進行鏡檢，通過對菌落的形態以及革蘭氏染色結果進行分析。基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜法是將真菌接種到靶板上，然后再菌膜沒有完全干燥之前加入α-腈基-4-羥基肉桂酸基質，等待基質和菌株混合物完全干燥后將樣本放入儀器中進行分析掃描，利用數據庫進行鑒定，判斷菌株種類。結果結果可信程度在60.0%-99.9%之間且結果為一個是認為該結果可以接受。

1.4 統計學分析

所有數據均采用統計學軟件SPSS19.0進行統計分析，計量資料采用百分比表示，進行卡方檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 真菌鑒定種類分布

經過鑒定，300株真菌種類分別為：熱帶念珠菌、白色念珠菌、阿薩斯酵母菌、煙曲霉米曲霉、宛氏擬青霉、煙草赤星病菌，詳細數據見下表。

2.2 兩種方法鑒定真菌的正確率比較

本次研究采用了兩種真菌鑒定方法，常規鑒定組共檢查300株真菌，其中正確的有156株，正確率為52.00%，100例檢查錯誤，44例未檢出；基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術共檢查300株真菌，其中290株檢查正確，正確率為96.67%， 6株（2%）未能給出鑒定成果，4株（1.33%）鑒定結果出現錯誤。兩組檢查方法正確率存在差異，基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術檢查正確率遠高于常規鑒定組，且差異具有統計學意義（P<0.05）。詳細數據見表2

3 討論

基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術是近年來出現的一種軟電離新型有機質譜，這種新的技術手段已經廣泛應用于生物、醫學行業，是檢測和鑒定多肽大分子物質以及蛋白質的有效手段，具有十分高的靈敏度，并且檢測的準確率高，操作簡單，檢測周期短，穩定性高，是十分方便快捷的技術[11-13]。基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術可應用于多個領域，其中基于細菌表面蛋白分子量進行細菌鑒定的技術尤為引人注意。通過將微生物和等量的基質分別點加在加樣板上形成混合物，然后利用激光的能量使樣品解離，通過計算不同物質飛行時間不同來檢測離子分子量，然后應用質譜技術對結果進行處理，生成特異性的蛋白質組指紋圖，從而進行對比分析，鑒定微生物種類[14-16]。由于這種檢測方法是利用蛋白質圖譜來進行的，而每種微生物的蛋白組成受遺傳因素的影響，不受外界環境等因素的制約，因此相對于其他的檢測手法，這種蛋白質圖譜法能更為直觀準確的進行微生物的鑒定。endprint

在本次研究中，我們發現新的基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術檢查的正確率為96.67%，遠遠高于傳統的檢查手法，說明基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術具有準確率高的特點，并且在進行實際的操作實驗中，傳統的實驗方法是基于形態學或生理生化特性進行鑒定，需要的時間較長，且操作繁瑣，而且對于一些相似的菌種鑒別過程仍然存在一定的困難；但是利用這種新型技術操作的時間就大大減少，首先進行2-3天的菌株培養，等待菌株生長完成后進行樣本的制備，該過程僅需花費不到半個小時，因此時間大大的減少。曾有研究表明[17]，基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術常見的人畜病原菌檢測中具有較好的準確率，對于單增李斯特菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌等病原菌都有十分高的準確率。Phillips等曾經對對來自病人的437個菌株進行基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜測試，差異結果用16S 基因進行分析，結果發現該方法鑒定菌株的正確率高達95.1%[18]。同時對980 株來自臨床的細菌和酵母菌株進行確認，發現基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術鑒定種的正確率（95.34%）明顯高于傳統的生化鑒定系統（83.1%）。并且，這種新型技術可以直接檢測來自醫院臨床病人的樣本，不需要經過純培養，因此檢測時間短，對于患者的臨床診斷以及治療有很大的幫助作用，在急性病原菌感染患者的檢測和治療上均有十分廣闊的應用前景[19，20]。

綜上所述，基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術在微生物鑒定上具有高正確率、高敏感性以及高穩定性，并且操作簡單，鑒定周期短，價格低廉，適合在臨床上進行推廣應用。

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