PTEN與Survivin分子在腎透明細胞癌組織中差異表達的意義

徐芝立 張麗紅 張翼 梁長春 馬志強

·論著·

PTEN與Survivin分子在腎透明細胞癌組織中差異表達的意義

徐芝立 張麗紅 張翼 梁長春 馬志強

目的檢測腎透明細胞癌組織中PTEN與Survivin蛋白分子的表達差異，探討其在基因靶向治療和外科手術中的應用價值。方法利用Western blot實驗檢測腎透明細胞癌組織、癌旁0.5 cm腎組織以及癌旁1.0 cm腎組織中PTEN與Survivin蛋白分子的表達量差異并進行相關分析。結果Western Blot實驗檢測PTEN蛋白相對表達量：癌組織的PTEN蛋白表達水平(1.482±0.320)明顯低于癌旁0.5 cm組(10.861±1.347)以及癌旁1.0 cm組(10.947±1.744)，差異有統計學意義(Plt;0.05)。癌旁0.5 cm組與癌旁1.0 cm組的PTEN蛋白表達水平差異無統計學意義(Pgt;0.05)。Western Blot實驗檢測Survivin蛋白相對表達量：癌組織的Survivin蛋白表達水平(17.113±3.367)明顯高于癌旁0.5 cm組(3.233±1.898)以及癌旁1.0 cm組(2.924±1.612)，差異有統計學意義(Plt;0.05)。癌旁0.5 cm組與癌旁1.0 cm組的Survivin蛋白表達水平差異無統計學意義(Pgt;0.05)。Pearson相關分析顯示，癌組織中的PTEN蛋白與Survivin蛋白的表達水平呈現負相關性(r=-0.908，Plt;0.05)。結論PTEN和Survivin基因可能共同促進了腎癌的發生與發展，對基因靶向治療和外科手術切口有應用和指導價值。

Survivin基因；PTEN基因；Western blot；腎透明細胞癌

腎癌是泌尿生殖系統常見腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的80%～90%，占成人惡性腫瘤的3%，近年來的發病率逐漸提高，大約60%的新發病例被偶然發現，其中約四分之一的患者確診時已經出現腫瘤轉移[1]。盡管腫瘤分級、分期以及脈管浸潤程度能有效預測腎癌的惡性行為，但相同臨床分期、分級的腫瘤患者預后卻有明顯差別，這說明腎癌在發生進展過程存在顯著的異質性[2]。因此，尋找有效預測腎癌進展與預后轉歸的瘤標分子對于腎癌患者的臨床治療和預后判斷有重要導意義。現代分子生物學認為，惡性腫瘤的發生、發展與某些抑癌基因的失活、原癌基因的激活密切相關。PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome10)，又稱MMAC1或TEP1，是人體第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因，在眾多惡性腫瘤中頻繁丟失與突變，促進了腫瘤細胞增殖，抑制了腫瘤細胞凋亡，與腫瘤惡性進展密切相關[3,4]。Survivin基因是凋亡抑制蛋白IAP家族的重要成員，可以調控腫瘤細胞凋亡與侵襲，腫瘤間質血管生成等過程，參與了多種惡性腫瘤的發生和發展。臨床研究發現，尤文氏肉瘤、小細胞肺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤的發生、發展、不良預后與Survivin基因密切相關[5-7]。還有學者發現，腎癌組織中Survivin基因表達增高與患者總生存時間及腫瘤特異性生存時間呈反向相關，提示Survivin分子表達增加促進了腫瘤的惡性發展[2]。由于PTEN與Survivin基因在人體癌組織與正常組織中存在的顯著表達差異，使其成為腫瘤基因靶向治療的理想靶點。腎癌又名腎腺癌，其主要病理類型是透明細胞癌。我們的課題擬利用Western blot實驗精確檢測腎透明細胞癌組織、癌旁0.5 cm正常腎組織以及癌旁1.0 cm正常腎組織中PTEN與Survivin分子表達量的差異，了解腎癌發展過程中兩分子的表達變化及相關性，為進一步針對腎透明細胞癌患者開展PTEN與Survivin基因功能研究和靶向治療提供實驗依據，也為早期局限性腎癌患者施行腎臟部分切除術選取安全手術邊距提供分子學實驗依據，筆者在國內尚未見相關報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013至2015年我院泌尿外科腎癌患者施行根治性腎切除的離體新鮮腎臟標本16例。其中男11例，女5例;年齡53～78歲，平均年齡(61±9)歲；患者均無腎炎、腎病、腎衰、腎盂腎炎及糖尿病、免疫性疾病史，術前均未接受放化療、免疫靶向藥物治療。所有腎癌標本經過HE染色、讀片，確診為腎透明細胞癌。分3組于癌組織、癌旁0.5 cm處、癌旁1.0 cm 處取材。組織細胞裂解液(RIPA)、蛋白酶抑制劑(PMSF)、蛋白上樣緩沖液均購自北京索萊寶公司，兔抗人PTEN單抗(ab32199)、Survivin單抗(ab76424)、β-actin單抗(ab8227)以及羊抗兔熒光二抗(ab131366)均購自英國Abcam公司。所有實驗研究有患者知情同意授權。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織細胞裂解：新鮮組織用微型粉碎器粉碎后，收集到1.5 ml EP管中。加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，吹打混勻，冰置15 min。4℃，10 000 g離心20 min，收集上清為細胞總蛋白，進行后續實驗。

1.2.2 Western Blot實驗：將提取的總蛋白先行定量測定，酶標儀測定波長為572 nm時的吸光度值，根據標準曲線計算蛋白樣品的濃度。取適量蛋白樣品加入SDA-PAGE凝膠中4℃條件下，恒壓90 V，電泳，分別切下包含50～60 kDa (PTEN)、16～20 kDa (Survivin)、37～50 kDa (β-actin)蛋白區帶凝膠，置于轉膜緩沖液中浸泡轉膜，滴加一抗，4℃孵育過夜，滴加二抗，孵育，洗滌，Odyssey雙色紅外熒光掃描系統分析結果。

2 結果

2.1 Western Blot實驗檢測PTEN蛋白相對表達量 癌組織的PTEN蛋白表達水平(1.482±0.320)明顯低于癌旁0.5 cm組織(10.861±1.347)以及癌旁1.0 cm 組織(10.947±1.744)，差異有統計學意義(Plt;0.05)。癌旁0.5 cm組織與癌旁1.0 cm組織的PTEN蛋白表達水平差異無統計學意義(Pgt;0.05)。見表1，圖1、2。

2.2 Western Blot實驗檢測Survivin蛋白相對表達量 癌組織的Survivin蛋白表達水平(17.113±3.367)明顯高于癌旁0.5 cm組織(3.233±1.898)以及癌旁1.0cm組織(2.924±1.612)，差異有統計學意義(Plt;0.05)。癌旁0.5 cm組織與癌旁1.0 cm組織的Survivin蛋白表達水平差異無統計學意義(Pgt;0.05)。見表1，圖1、2。

表1 不同部位腎癌標本中PTEN與Survivin蛋白相對表達量

注：與癌組織比較，*Plt;0.05

圖1 不同部位腎癌標本中PTEN與Survivin蛋白表達差異

圖2 不不同部位腎癌標本Survivin及PTEN蛋白電泳條帶

2.3 Pearson相關分析顯示，癌組織中的PTEN蛋白與Survivin蛋白的表達水平呈現負相關性(r=-0.908，Plt;0.05)。見圖3。

圖3 腎癌標本中PTEN與Survivin蛋白表達相關分析散點圖

3 討論

PTEN是人類惡性腫瘤中缺失和突變率最高的抑癌基因。Esteva等[8]對乳腺癌的研究發現，PTEN基因的突變、丟失和甲基化導致的分子表達異常與腫瘤的分化、轉移和預后等明顯相關。在泌尿系統惡性腫瘤的研究中也發現了該基因的突變與失活，這導致PTEN蛋白表達出現異常，促進了腫瘤的發生、進展過程[4,9]。

基礎研究顯示，PTEN基因位于人類染色體10q23.3，廣泛表達于人體正常組織細胞，具有編碼脂質磷酸酶和蛋白磷酸酶的雙重特異性磷酸酶活性，可以通過阻斷PIP3/PI3K/AKT通路、負向調節絲裂原激活的蛋白激酶信號通路以及調控P53/MDM2通路和NF-KB/IKB信號通路等影響腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等過程[10]。例如：通過使黏著斑激酶(FAK)去磷酸化引起FAK失活，下調其下游調控信號p130CAS，控制細胞的存活和黏附、運動，調節細胞的轉移與侵襲功能[11]；在結腸癌的研究中，Roy等[12]學者發現抑癌基因PTEN可使PIP3轉化成PIP2，進而阻斷PIP3/PI3K/AKT信號通路，抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。另外，還有學者發現抑制PTEN/PI3K/AKT 通路的激活可有效抑制前列腺癌細胞的增殖和轉移[13]。

Schneider等[14]用Western Blot實驗對腎癌組織檢測發現，低表達PTEN的大部分腎透明細胞癌患者多死于腎癌轉移，提示腎癌組織PTEN蛋白參與了腫瘤的惡性進展，PTEN表達下降與腫瘤不良預后密切相關。本實驗利用Western Blot技術對新鮮離體腫瘤標本的不同部位進行取材并定量測定PTEN蛋白表達量。實驗發現，腎癌組織的PTEN蛋白表達水平明顯低于癌旁0.5 cm處腎組織，也明顯低于癌旁1.0 cm 處腎組織，而后兩者的PTEN蛋白表達水平無顯著差異，這表明了在正常腎組織漸變至癌組織的過程中PTEN基因突變或缺失所導致的蛋白表達變化，說明PTEN蛋白表達與腎癌發生與進展密切相關。

Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族的新成員，Survivin基因位于人類染色體17q25，片段長14.7 kb，編碼142個氨基酸組成的蛋白，分子質量約16.5 kDa，含有桿狀病毒IAPs(inhibition of apoptosis proteins)序列，是1997年由Ambrosini等利用效應細胞蛋白酶受體-1(effector cell protease receptor-1，EPR-1)cDNA在人類基因組庫的雜交篩選中分離出來的[15]。Survivin分子高表達在人的胚胎組織和多種惡性腫瘤細胞中，除胸腺和生殖腺外，在人類正常分化成熟的組織中檢測不到Survivin表達，參與抑制細胞凋亡、調控細胞增殖和促進腫瘤血管生成等生理過程，并在多種惡性腫瘤中呈現高表達，與腫瘤進展密切相關[7,16]。

在泌尿系統腫瘤的臨床研究中，Xiong等[2]通過meta分析發現腎癌腫瘤組織中Survivin基因表達增高，會導致患者腫瘤特異性生存時間下降，認為Survivin促進了腫瘤惡性進展過程。學者Wang等[17]報道Survivin分子高表達在前列腺癌組織中，且外周血循環腫瘤細胞的Survivin mRNA水平與前列腺癌遠轉移率明顯相關，更進一步揭示出Survivin基因表達可能通過促進腫瘤細胞的侵襲轉移行為而參與了腫瘤進展機制。本實驗發現，腎癌組織的Survivin蛋白表達水平明顯高于癌旁0.5 cm處腎組織，也明顯高于癌旁1.0 cm處腎組織，這說明Survivin基因表達水平在腎癌組織及癌旁組織中的變化體現了腎臟細胞癌變的發生與進展過程，Survivin基因表達對腎癌發揮促癌作用。

腫瘤的迅速增殖、組織浸潤、血管侵襲、轉移及耐藥產生是影響腫瘤預后的重要因素，Survivin能參與其中多個過程而顯著降低腫瘤的治療效果和縮短總生存時間，是惡性細胞轉化的標志[18]。在腫瘤細胞中，Survivin主要表現為兩種功能作用[19]：(1)調控細胞有絲分裂影響細胞增殖。Survivin通過與紡錘體微管蛋白特異性結合形成染色體乘客絡合體(chromosomal passenger complex，CPC)，穩定微管結構，防治紡錘體被水解，保護有絲分裂細胞器的完整性，有利于有絲分裂持續進行，促進腫瘤細胞不斷增殖。Survivin基因高表達可以促進細胞由G1期向S期轉換，在G2/M期可見Survivin表達明顯升高[20]。(2)抑制細胞凋亡。Survivin蛋白的IAPs重復序列可以直接與凋亡通路下游蛋白酶Caspase3和Caspase7相結合，發揮直接的抗凋亡作用。Survivin蛋白與X連鎖凋亡抑制蛋白結合形成的Survivin-XIAP復合體可以抑制Caspase9的活性而發揮間接的抗凋亡作用。另外，腫瘤組織中Survivin基因的高表達增強了β-catenin、T細胞因子以及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的轉錄活性與表達水平；提示Survivin基因可能促進腫瘤間質中血管的形成，而這種促進基質血管形成的能力是腫瘤侵襲轉移的必需因素[21]。

眾多研究已證實，腫瘤抑制基因PTEN的純合型或雜合性丟失可以導致磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)信號網絡的異常激活，這在腫瘤發展中是最重要的常見事件之一，尤其多見于惡性侵襲與轉移性腫瘤疾病中。所以，PTEN經常單獨或與其他分子聯合作為預測腫瘤預后的生物標記物[22]。而PI3K可以通過產生許多因子和調控各種細胞通路促進細胞生長增殖與分化，其中包括極為重要的PI3K/PIP3/AKT通路。有學者研究髓樣白血病發現，PI3K途徑在mRNA和蛋白水平均對Survivin有調控作用[23]。我們的實驗對PTEN和Survivin 蛋白表達量進行相關分析發現，兩個蛋白分子的表達水平呈現顯著負相關性，這表明PTEN和Survivin 基因很可能通過調控細胞周期與凋亡的機制共同參與腎癌的發展過程。據此可以推理：在正常生理情況下，PTEN基因抑制PI3K/Akt通路，從而抑制Survivin的表達；而在腫瘤細胞PTEN基因表達下調或缺失的異常情況下，PTEN對PI3K/Akt通路的抑制作用減弱，Survivin表達上調，促進細胞分裂與增殖，抑制細胞凋亡，促進腎癌的形成與惡性進展。

由于PTEN和Survivin基因在人體正常組織和腫瘤組織中表達水平的明顯差異，使其成為基因靶向治療的理想靶分子。因此，針對PTEN和Survivin基因的分子機制研究和靶向治療策略已經成為腫瘤防治的重點領域。勞玲娟等[24]利用RNA干擾技術，降低直腸癌細胞株SW480的PTEN表達，可顯著削弱白藜蘆醇對體外SW480細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用，證實PTEN在白藜蘆醇發揮抗直腸癌效應中發揮了主導作用。在胃癌移植瘤模型中，利用Survivin顯性負性突變體C84A，可以抑制胃癌瘤體生長，并可增強5-氟尿嘧啶對胃癌細胞的化療效果[17]。這些研究表明，下調Survivin表達能阻抑腫瘤的發生、惡性發展，Survivin作為腫瘤抗原基因具有應用于腫瘤基因治療的巨大潛力。

根治性腎切除術歷來是針對腎癌的金標準手術方式。但是近年來，對于局限性腎癌患者，腎部分切除手術逐漸被接受和推崇。對于直徑≤4.0 cm的腎臟腫瘤，實施保留腎單位的腎部分切除手術，其術后無瘤生存率和局部復發率與根治性腎切除手術有相似的效果。如何更好地確定保留腎部分切除術的安全手術邊距成為眾多外科醫師極為關心的問題。我們的實驗發現癌旁0.5～1.0 cm范圍內的腎組織沒有出現顯著的PTEN基因表達下調及Survivin基因表達增加，這從分子學水平上提示，腎部分切除術的安全手術邊距可以確定為腫瘤假包膜外0.5～1.0 cm范圍腎組織。

總之，本實驗檢測到腎癌及癌旁組織的PTEN和Survivin 蛋白表達量有明顯差異，兩個基因分子可能共同促進了腎癌的發生與發展。雖然眾學者的實驗結果已經強烈提示了PTEN和Survivin 在腫瘤發生進展中的潛在相互作用機制，仍需進一步進行分子信號通路的研究，并進行動物模型實驗進行驗證。實驗結果顯示了PTEN和Survivin 作為免疫治療靶分子的巨大潛力，并為保留腎單位的腎部分切除術確定安全手術邊距提供了有力的實驗依據。

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SignificanceofdifferentialexpressionofPTENandSurvivininhumanrenalclearcellcancer

XUZhili,ZHANGLihong,ZHANGYi,etal.

DepartmentofUrology,TheThirdHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveTo investigate the differences of expressions of PTEN and Survivin in human renal clear cell cancer and tumor adjacent tissues,and to explore their application value in gene-targeted therapy and surgery.MethodsThe expression level of PTEN and Survivin protein in human renal clear cell cancer tissues,tumor adjacent tissues (0.5cm) and adjacent tissues (1.0cm) were detected by Western Blot,moreover, the differences of expressions of PTEN and Survivin were observed,and the correlation of expressions between PTEN and Survivin was analyzed.ResultsThe expression levels of PTEN protein in cancer tissues were significant lower than those in adjacent tissues of cancer (0.5cm) (1.482±0.320 vs 10.861±1.347,Plt;0.05) and lower than those in adjacent tissues of cancer (1.0cm) (1.482±0.320 vs 10.947±1.744,Plt;0.05). However there were no significant differences in the expression levels of PTEN protein between adjacent tissues of cancer (0.5cm) and adjacent tissues of cancer (1.0cm)(Pgt;0.05).The expression levels of Survivin in cancer tissues were significant higher than those in adjacent tissues of cancer (0.5cm) (17.113±3.367 vs 3.233±1.898,Plt;0.05) and higher than those in adjacent tissues of cancer (1.0cm) (17.113±3.367 vs 2.924±1.612,Plt;0.05). However there were no significant differences in the expression levels of Survivin between adjacent tissues of cance (0.5cm) and adjacent tissues of cancer (1.0cm)(Pgt;0.05).Besides the Pearson correlation analysis showed that the expression levels of PTEN protein were negatively correlated with those of Survivin protein in cancer tissues (r=-0.908,Plt;0.05).ConclusionPTEN and Survivin gene may jointly promote the pathogenesis and development of renal cancer,which has potential application and instruction value for gene-targeted therapy and surgery.

Survivin gene; PTEN gene;Western Blot; renal clear cell cancer

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.24.002

項目來源：石家莊市科學技術研究與發展指導計劃(編號：131462333)

050011 河北省石家莊市第三醫院泌尿外科

R 737.11

A

1002-7386(2017)24-3689-05

2017-07-28)