肺痿論治干預肺纖維化大鼠肺功能的實驗研究

康荻 李彧 朱曼 唐磊 申萌萌 常立國 黃春芳 王繼峰 牛建昭 李亞東

摘要 目的：比較麥門冬湯和甘草干姜湯在肺纖維化階段對大鼠模型肺功能的干預作用。方法：用博萊霉素造模14 d的SD大鼠，灌胃麥門冬湯（7.5 g/kg、15 g/kg、30 g/kg）和甘草干姜湯組（3.75 g/kg、7.5 g/kg、15 g/kg），模型組和正常組大鼠灌胃等體積飲用水。中藥灌胃14 d后檢測用力肺活量（FVC）、肺動態順應性（Cdyn）、0.4秒率（FEV0.4/FVC%）、呼氣峰值流速（PEF）、最大呼氣中期流速（MMF）等指標，檢測血氣變化，稱量臟器質量、計算臟器系數，HE染色觀察肺組織病理。結果：麥門冬湯高劑量組能夠降低模型動物肺臟質量、肺臟系數（P<0.05），提高肺順應性、FVC和質量FVC（P<0.05）；甘草干姜湯高劑量能夠改善肺順應性和FVC（P<0.05）；甘草干姜湯中劑量能夠改善質量FVC、降低0.4秒率（P<0.05），保護非纖維化區肺泡結構；甘草干姜湯能夠提高肺纖維化大鼠的PO2和SO2（P<0.05）。結論：麥門冬湯和甘草干姜湯對博萊霉素所致肺纖維化大鼠肺臟功能均具有改善作用，前者主要是改善氣道周圍纖維化區的間質增生，后者主要是保護非纖維化區的肺泡結構和功能。

關鍵詞 甘草干姜湯；麥門冬湯；質量FVC；血氣分析；肺順應性

Abstract Objective：To observe different effects of Maimendong Decotion and Gancao GanjiangDecotionin on pulmonary fibrosis rat in the stage of fibrotic phase.Methods：After 14 days of establishing rat model by intratracheal injection of bleomycin，Maimendong decotion（7.5 g/kg，15 g/kg，30 g/kg） and Gancao Ganjiang decotion（3.75 g/kg，7.5 g/kg，15 g/kg） were given by gavage once a day for 2 week.Meanwhile，the model group and the normal group were administered with distilled water of same quantity.After gavage of decotion for 14 days，the forced vital capacity （FVC），the indexes of lung dynamic compliance（Cdyn），the ratio of FEV 0.4 to forced vital capacity（FEV0.4/FVC%），peak expiratory flow rate （PEF），maximal mid-expiratory flow rate （MMF） and the blood gas changes were recorded，then the organ coefficients were calculated，lung tissue and airway pathologic changes were observed by HE staining.Results：Compared with the model group，the high dose group of Maimendong decotion reduced the lung weight and lung index significantly（P<0.05），and increased Cdyn，FVC and FVC/lung weight significantly（P<0.05）.The Cdyn and FVC of high dose group of Gancao Ganjiang decotion were higher than the model group（P<0.05）.The intermediate-dose Gancao Ganjiang decotion improved FVC/lung weight （P<0.05） and reduced the rate of FEV0.4/FVC% significantly （P<0.05） compared with the model group.Gancao Ganjiang decoction improved PO2 and SO2 significantly compared to model group（P<0.05）.Conclusion：Both Maimendong decotion and Gancao Ganjiang decotion are better for the rat model of bleomycin induced pulmonary fibrosis.The former can reduce the interstitial hyperplasia around the airway in fibrosis area，and the latter protect the structure and function of the alveolar in non-fibrosis area.

Key Words Gancao Ganjiang Decotion； Maimendong Decotion； FVC/lung weight； Blood gas analysis； Dynamic compliance

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.038

肺痿一詞出自張仲景《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治第七》，屬于中醫病名，結合歷代醫家論述及現代臨床觀察發現中醫所論肺痿與肺纖維化疾病相關[1]，并有多位中醫專家提出了從肺痿論治肺纖維化的思路[2-3]?！督饏T》論治虛熱肺痿，“止逆下氣”用麥門冬湯；論治虛寒肺痿，溫扶陽氣用甘草干姜湯[4]。甕恒[5]等通過臨床觀察發現麥門冬湯能夠改善特發性肺纖維化患者的肺功能；陸國輝等[6]則發現甘草干姜湯能夠減輕博萊霉素導致的大鼠模型肺纖維化程度，可見肺痿論治的2組中藥方劑具有一定抗肺纖維化效果，但未見比較二者的生物藥效機制。而臨床肺纖維化患者病因病機紛繁復雜，證候輾轉，博萊霉素所致肺纖維大鼠模型化進展明確、病理穩定[7]，是國際上使用最廣泛的鼠類肺纖維化造模方法[8]。我們擬通過灌胃麥門冬湯和甘草干姜湯比較肺痿論治的2組方劑在該模型肺纖維化階段的干預效果。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠54只，12～13周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司（動物合格證號為11400700093856），動物許可證號為SCXK（京）2012-0001。

1.2 試劑 中藥飲片由河北美威藥業股份有限公司提供，注射用鹽酸博萊霉素15 mg/瓶（日本化藥株式會社產品，批號：650472）。

1.3 儀器 動物肺功能儀（北京貝蘭博科技有限公司生產，AniRes 2005）；i-STAT200便攜式血氣分析儀及血氣測試芯片EG3+（雅培，美國）；數字切片掃描儀（由日本濱松光子學株式會社生產，NanoZoomer-SQ）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，AL204）。

1.4 方法

1.4.1 中藥湯劑制備 麥門冬湯（麥冬42 g，甘草6 g，生曬參9 g，梗米10 g，半夏6 g，大棗20 g）和甘草干姜湯（炙甘草12 g，干姜6 g）按照人民衛生出版社《方劑學》第七版組方，均采用水煎提取2次，合并濾液濃縮至生藥濃度麥門冬湯4 g/mL，甘草干姜湯2 g/mL，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.4.2 模型制備與分組 在符合清潔級標準的實驗室（溫度22～25 ℃，濕度50%～70%）適應飼養2周后，隨機分為8組：正常組、模型組、麥低組、麥中組、麥高組、甘低組、甘中組、甘高組。正常組不加任何干預，其他各組大鼠于14周齡進行氣管內注射博萊霉素（5 mg/kg），建立肺纖維模型。造模后第14天麥低組、麥中組、麥高組分別按7.5 g/kg、15 g/kg、30 g/kg的濃度灌胃麥門冬湯水煎液，甘低組、甘中組、甘高組分別按3.75 g/kg、7.5 g/kg、15 g/kg的濃度灌胃甘草干姜湯水煎液，模型組灌胃等量飲用水，連續給藥14 d。

1.4.3 檢測指標與方法

1.4.3.1 肺功能檢測 按設備提供的實驗技術指導調試儀器確認系統正常。1%戊巴比妥鈉按（70 mg/kg）腹腔內注射進行麻醉。行氣管切開術后插管，將插管與氣管結扎固定，以仰臥位將大鼠置于體描箱內，啟動呼吸機，設置呼吸比20∶10，呼吸頻率75次/min。以壓力控制方式（30 cmH2O）檢測用力肺活量（FVC）、肺動態順應性（Cdyn）、0.4秒率（FEV0.4/FVC%）、呼氣峰值流速（PEF）、最大呼氣中期流速（MMF）等功能指標。

1.4.3.2 臟器系數的計算 肺功能檢測完成后，腹主動脈放血處死動物，取出肺臟，去除肺外支氣管；取脾臟，剔除白色脂肪組織及系膜；取腎臟，剝除臟膜。電子天平稱重，根據臟器系數計算公式：臟器系數=臟器質量（g）/動物體重（g）×100%。

1.4.3.3 病理觀察 取左肺，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，冠狀面切片，行HE染色。用數字切片掃描儀獲取切片圖像進行肺組織病理觀察。

1.4.3.4 血氣分析 肺功能檢測結束后迅速打開腹腔，腹主動脈取血0.5 mL進行血氣分析。測定酸堿度（pH）、氧分壓（PO2）、二氧化碳分壓（PCO2）、氧飽和度（SO2）等。

1.5 統計學方法 應用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析：計量資料用均數±標準差（±s）表示。符合正態分布的計量資料采用單因素ANOVA進行檢驗；對于不符合正態分布的計量資料，采用秩和檢驗。以雙側P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臟器質量和臟器系數

氣管內注射博萊霉素造成模型大鼠肺纖維化，模型組體重相對于正常組下降顯著（P<0.05），由于氣管內注射容易受麻醉狀態和個體差異影響造成體重標準差較正常組增加；與模型組相比灌胃2種方劑體重比較，差異無統計學意義；模型組大鼠由于炎性反應和間質增生造成肺臟質量、肺臟系數增加顯著（P<0.05），麥高組能夠降低病變肺臟的質量和肺臟系數（P<0.05）。見表1。

2.2 氣道阻力及肺順應性

與正常組相比所有致纖維化組均出現呼氣相氣道阻力（Re）升高（P<0.05），結合這些致纖維化組相對正常組動態順應性（Cydn）下降（P<0.05），提示病變可能由氣道障礙和（或）肺間質增生導致氣腔張力增加所致；其中麥高組和甘高組相對模型組Cydn顯著升高（P<0.05）。見表2。

2.3 肺功能檢測結果

模型組與正常組大鼠相比PEF和MMF均降低（P<0.05），提示存在氣道阻礙；結合FVC比正常組顯著降低（P<0.05），降幅超過80%（參考臨床），而0.4秒率（FEV0.4/FVC%）升高（P<0.05），提示博萊霉素所致肺纖維為限制性伴阻塞性（或限閉性）肺功能障礙。麥高組能夠提高模型動物FVC（P<0.05），甘中組則降低模型動物的0.4秒率（P<0.05），同時改善氣道阻力（P<0.05）。見表3。

2.4 質量FVC

質量FVC是FVC/肺質量的比值，由圖1可見博萊霉素能夠引起模型組動物質量FVC顯著下降，而灌胃麥門冬湯中、高劑量和甘草干姜湯中、高組劑量均能升高病變動物的質量FVC（P<0.05）。

2.5 血氣分析

模型組動物腹主動脈血氧分壓（PO2）和血氧飽和度（SO2）相對于正常組下降（P<0.05）。2種方劑各劑量組的血氣結果差異無統計學意義，故將各組結果合并比較發現：相對于模型組，甘草干姜湯能夠提高PO2和SO2（P<0.05），麥門冬湯只能單純升高PO2，SO2差異無統計學意義。見表4。

2.6 病理觀察

模型大鼠肺組織病理可分為纖維化區和非纖維化區，纖維化區由于肺泡被填充或間質增生塌陷，已喪失氣體交換能力，因此考慮觀察非纖維化區的肺泡結構來分析氣血功能。正常組肺泡壁自然回彈，肺泡上皮細胞間距離縮短、排列整齊；毛細血管床豐富，可見紅細胞分布。模型組可見肺泡間質內成纖維細胞增生，肥厚的肺泡壁回彈受阻，肺泡腔增大；毛細血管床受壓、血流受阻，可見紅細胞分布減少。麥中組肺間質也明顯可見成纖維細胞填充，紅細胞分布減少。甘中組肺間質較少受累于成纖維細胞，可見豐富的毛細血管床和大量紅細胞分布。見圖2。

3 討論

質量FVC（FVC/肺質量單位）是課題組在實驗中摸索的一個用于反應纖維化過程中肺組織結構與功能關系的指標。隨著肺纖維化進展，肺臟質量增加，而FVC下降（受到增生的肺間質限制和或正常肺泡區域占比減少）。FVC/肺質量相對更加全面評價纖維化的病變程度，能夠避免病理切片由于取材部位不均和個體差異的影響。從實驗結果來看：質量FVC能夠靈敏的反應出用藥組與模型組間的差異，而單純肺臟質量、肺臟系數以及肺功能的各項指標均未能靈敏地反映出用藥組的變化。

李瑞琴[9]等曾探討麥門冬湯對肺纖維化早期炎性反應的影響，楊美鳳[10]等則研究了麥門冬湯對肺纖維化形成階段的影響。本研究認為中醫肺痿已遠離早期炎性反應，多已進入肺纖維化進展階段，故將給藥時間窗調整到造模14 d開始，此時已進入纖維化期[7]。結果發現灌胃麥門冬湯高劑量能夠改善病理，與楊美鳳等[10]一致；此外還能夠降低肺臟質量、肺臟系數，提示纖維化大鼠的炎性反應或ECM沉積得到改善；結合肺順應性、FVC和質量FVC同時升高，明確高劑量麥門冬湯確實能夠改善肺功能。但0.4秒率卻未見好轉，結合仍存在氣道功能障礙以及病理可見博萊霉素所致肺纖維化為氣道中心性病變，提示高劑量麥門冬湯對于肺功能的改善可能得益于對氣道周圍纖維化區的緩解。

甘草干姜湯高劑量對于肺功能的影響與灌胃麥門冬湯高劑量十分類似，但肺質量和肺臟系數未見改善，提示甘草干姜湯高劑量組對于肺功能的改善可能不在纖維化區，而是對非纖維化區肺泡功能的改善，中劑量組0.4秒率明顯改善也進一步證明了這一點。病理結果可見甘草干姜湯中劑量組能夠抑制正常肺泡區間質增生，保持肺泡正常結構，延緩纖維化進展。其分子機制可能與陸國輝等[6]報道甘草干姜湯能夠下調TGF-β1、Smad3和SIRT1蛋白表達，并上調Smad7蛋白表達有關。血氣分析結果則顯示甘草干姜湯能夠升高纖維化大鼠動脈血的PO2和SO2，也進一步證實甘草干姜湯能夠改善肺泡的氣體交換功能。孫成成等[11]報道1/10的肺纖維化住院患者使用了復方甘草，覃冬云等[12]發現甘草酸對血清和組胺誘發的大鼠氣道平滑肌細胞的增生具有抑制作用；營大禮[13]報道干姜能夠改善局部血液循環，進一步提示甘草干姜湯的藥效作用可能在于保護和改善肺泡功能。

最新的肺纖維化診斷共識強調肺纖維化患者肺功能主要表現為限制性通氣功能障礙、彌散量降低伴低氧血癥或Ⅰ型呼吸衰竭[14]。而麥門冬湯和甘草干姜湯對于博萊霉素所致肺纖維化大鼠模型的肺功能均具有改善作用，前者主要是改善氣道周圍纖維化區的間質增生，后者主要是保護非纖維化區肺泡結構和改善氣體交換功能，提示臨床用藥是否也存在相似機制，根據2組方劑的作用特點是可否通過交替服用改善肺纖維化患者肺功能值得思考。

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