過氧化氫對小球藻干質量和油脂含量的影響

王元琮， 何 冰

(江蘇省農業科學院種質資源與生物技術研究所，江蘇南京 210014)

利用微藻生產生物能源越來越受到人們的重視。微藻是一種可以高效利用光能和二氧化碳合成油脂的單細胞或簡單多細胞微生物，具有適應性強、生長快速、產油量高等特點。與植物類似，微藻可以通過光合作用將太陽能轉化為化學能并以糖、蛋白和油脂的形式存儲起來[1]。一般認為，當微藻處于逆境脅迫條件下，會限制自身的生長，同時提高自身的油含量，以更好地幫助自己適應環境[2]。

當植物處于逆境中時，體內會積累活性氧。微量的活性氧具有信號分子的作用，可以調節植物產生相應的反應，應對環境中的脅迫。但是當活性氧的積累量過多時，就會對植物產生傷害。過氧化氫(H2O2)是活性氧的一種，一般情況下在細胞中通過光呼吸形成。過氧化氫的過多積累會導致氧化性損傷，進而破壞細胞的新陳代謝和完整性，最終造成細胞死亡[3-4]。最近有研究表明，用微量H2O2處理海藻會促進其生長，高濃度的H2O2則會抑制微藻的生長[5-6]。也有研究認為，H2O2處理小球藻(Chlorellavulgaris)雖然可以顯著抑制其生長，但同時也能夠顯著提高其油含量，當H2O2濃度達到 4 mmol/L 時，總油脂產量會有顯著提高，更高濃度的H2O2則會完全殺死藻細胞[7-9]。一般認為，H2O2對微藻的毒性主要是因為H2O2在微藻細胞內可以轉化為活性極高的羥基自由基(·OH)，進而損傷細胞膜、蛋白質以及DNA[10-11]，在高濃度H2O2脅迫下，微藻會主動抑制結構物質的合成，降低生長速率，轉而把更多的能量以油脂的形式存儲起來[12-13]。盡管關于活性氧對于微藻的生長、油脂積累的影響已經有不少研究，但是關于外源H2O2處理對微藻基因表達的影響至今仍然缺乏相關報道。為了進一步分析活性氧對微藻干質量和油脂積累影響的分子機制，筆者以前一段時間報道的小球藻藻種ChlorellasorokinianaLS-2(以下簡稱LS-2)作為研究材料[14]，用不同濃度H2O2進行處理，并檢測LS-2的生長量、產油量以及相關基因的表達變化，以期為解析小球藻響應外源H2O2的分子機制提供一定的線索。

1 材料與方法

1.1 試驗藻種與試劑

本試驗所用藻種為筆者所在實驗室篩選出來的小球藻(Chlorellasorokiniana)LS-2[14]，已提交至中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC 8710。過氧化氫(H2O2，30%，分析純)購自西隴化工股份有限公司。

1.2 培養方法和條件

培養方法和條件參考已有的報道[15]，將藻種保存于液體Tris-Acetate-Phosphate(TAP)培養基內，接種時選用處于對數生長期的藻細胞，接入150 mL TAP培養基，保證接入后D680 nm=0.042。培養溫度為26 ℃，每天光—暗周期為12 h—12 h，光照度為4 800 lx。

培養基接入對數期藻細胞后，隨即加入適量H2O2至所需工作濃度。

1.3 藻細胞干質量的測定

取20 mL達到所需生長時間的藻細胞，放入50 mL離心管中離心收集藻細胞(5 000 r/min，5 min)。將收集下來的藻細胞放入烘箱，95 ℃烘20 min，然后調至75 ℃烘至恒質量，用分析天平稱量藻細胞的質量，計算得出干質量。

1.4 油脂提取

將生長9 d的藻液倒入50 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min后收集藻細胞。往離心管中加入5 mL濃鹽酸(HCl，38%)，置于75 ℃水浴20 min。取出離心管后加入5 mL無水乙醇，靜置冷卻至室溫。加入10 mL無水乙醚，渦旋振蕩 1 min，放入離心機內，于4 000 r/min離心1 min，分層后萃取上層并加入圓底燒瓶。重復3次直至萃取干凈。將圓底燒瓶放入旋轉蒸發儀，讓有機溶劑揮發干凈后稱質量，計算總脂含量，相關公式如下：

總脂產量(mg/L)=提取油脂質量(mg)/提取樣品體積(L)；

油脂含量(mg/g)=提取油脂質量(mg)/提取樣品干質量(g)。

1.5 RNA的提取和cDNA反轉錄

取處于對數生長期的不同處理的藻細胞，收集后用液氮研磨，加入TRIzol(Invitrogen)，按照說明書提取。提取的RNA用RNAase-free DNAase I(TaKaRa)于37 ℃處理 20 min，消化剩余的DNA。按照反轉錄試劑盒(TaKaRa)說明將產物總RNA反轉錄為單鏈cDNA。

1.6 統計分析

本試驗均重復3次，數據分析采用SPSS 19.0。多重比較采用的是最小顯著差數法(least significant difference，簡稱LSD)。P<0.05被視為差異顯著。2組樣本比較采用t檢驗方法(Student’st-test)，P<0.05視為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 過氧化氫濃度對小球藻(LS-2)干質量積累的影響

在TAP培養基中接入等量處于對數生長期的LS-2，并加入不同濃度的過氧化氫(0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L)，分別在3、6、9 d測定其干質量。圖1結果表明，隨著處理濃度的升高，微藻的生長速率受到抑制的程度越大，不同濃度過氧化氫對于干質量積累的抑制在處理3 d和處理6 d時較為明顯。接種LS-2后3 d，0.5 mmol/L H2O2處理的干質量為(0.385±0.025)g/L，比對照的(0.580±0.020)g/L下降了約33.6%。而用2.0 mmol/L H2O2處理的培養基中，LS-2幾乎無法檢測到生長。接種后6 d，對照干質量達到(2.028±0.376)g/L，不同濃度H2O2處理的干質量分別比對照下降了35.7%[0.5 mmol/L H2O2處理，(1.305±0.657)g/L]、66.2%[2.0 mmol/L H2O2處理，(0.686±0.103)g/L]。接種后9 d，對照干質量為(2.365±0.513)g/L，0.5、1.0 mmol/L H2O2處理在干質量上與對照均無顯著差異，分別為(2.258±0.187)、(2.258±0.065)g/L。當用1.5 mmol/L H2O2處理時，干質量下降約9.6%，為(2.137±0.019)g/L；H2O2濃度增至 2.0 mmol/L 時，干質量下降約17.3%，為 (1.955±0.033)g/L。以上結果表明，外源H2O2處理小球藻會抑制其生長速率，當濃度達到1.5 mmol/L時，會明顯降低LS-2的最大干質量。

2.2 過氧化氫處理對LS-2油脂積累的影響

為了探討H2O2對LS-2油脂積累的影響，筆者在接種 9 d 后分別提取了不同處理的LS-2的總油脂并進行測定。結果表明，H2O2處理對LS-2油脂總產量的影響不顯著(圖2-A)，但是2 mmol/L H2O2處理與對照處理相比，顯著增加了LS-2的油脂含量，提升了28.6%(圖2-B)。這與之前報道的H2O2在小球藻(Chlorellavulgaris)中產生的效果一致。

2.3 H2O2處理對LS-2碳固定相關基因表達的影響

為了進一步研究H2O2處理對LS-2生長影響的機制，筆者分別提取了處于對數生長期的對照和2 mmol/L H2O2處理微藻細胞的RNA，并通過實時熒光定量PCR(qPCR)檢測了相關基因的表達量，結果見圖3。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合作用不可或缺的關鍵酶。其功能是催化第1個主要的碳固定反應。本研究結果表明，2.0 mmol/L H2O2處理的LS-2中，其轉錄水平有了顯著提高，是對照轉錄水平的9倍(圖3-A)。磷酸甘油酸變位酶a(phosphoglycerate mutase a，簡稱PGKa)和醛縮酶(fructose-1，6-bisphosphate aldolase，簡稱ALDO)在LS-2卡爾文循環中位于Rubisco的下游，編碼它們的基因在2.0 mmol/L H2O2處理下轉錄水平僅為對照水平的1/2(圖3-B、圖3-C)。由此可見，在2.0 mmol/L H2O2處理下，雖然Rubisco轉錄有了提高，但卡爾文循環仍然受到了一定的抑制，這很可能是 2.0 mmol/L H2O2處理下微藻生長受到抑制的主要原因之一。

2.4 H2O2處理對LS-2油脂合成相關基因表達的影響

為了進一步解釋H2O2處理增加LS-2油脂含量的機制，筆者檢測了油脂合成途徑前2步的關鍵基因，即編碼乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)及其下游的編碼酰基載體蛋白(ACPa、ACPb)基因的轉錄水平。結果顯示， 2.0 mmol/L H2O2處理LS-2藻細胞ACCase的轉錄水平與對照處理相比變化不大，略有下降(圖4-A)。但是下游的ACPa、ACPb的轉錄水平都提升了1倍以上(圖4-B、圖4-C)。這有助于將ACCase催化的產物盡可能地轉化為丙二酰-ACP，并進入隨后的脂肪酸合成途徑，為盡可能多地合成脂肪酸提供了條件。

2.5 H2O2處理對LS-2糖酵解相關基因表達的影響

糖酵解途徑的中間產物可以作為油脂合成的底物。筆者進一步驗證了H2O2處理對LS-2中編碼糖酵解途徑最后2步的關鍵酶，即烯醇化酶(enolase，簡稱ENL)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，簡稱PK)的基因轉錄水平的影響。結果顯示，H2O2處理的藻細胞ENL的轉錄水平較對照上調了7倍(圖5-A)，但是其下游編碼關鍵酶的PKa、PKb轉錄水平較對照變化不大，其中PKa略有下調，PKb略有上調(圖5-B、圖5-C)，暗示這2種丙酮酸激酶可能受脅迫的影響略有不同。以上結果表明，LS-2藻細胞的糖酵解途徑并沒有受到外源H2O2的抑制。

3 討論與結論

植物在受到外界環境脅迫時，體內會積累包括過氧化氫在內的多種活性氧。之前有報道表明，高濃度的H2O2會導致Rubisco折疊錯誤，并且更容易失去活性[16]。此外，活性氧也可以作為信號分子，調節植物應對外界刺激時的基因表達[17]。本研究發現，H2O2處理小球藻會使編碼Rubisco蛋白的基因轉錄水平上調。筆者推測，這種轉錄水平的提高很可能是微藻為了應對這種狀況而產生的補償效應，因此盡管Rubisco的轉錄水平上調，其下游的卡爾文循環相關基因轉錄水平仍然受到了抑制。

之前有研究表明，微量的活性氧可以促進海洋微藻的生長，高濃度的活性氧則會對其生長產生抑制[5-6]。這種低濃度活性氧促進生長的效應在作物中也有發現[17]。本研究對小球藻LS-2和之前對小球藻(Chlorellavulgris)的研究都表明，H2O2處理會對其生長造成抑制，低濃度的H2O2僅在前期對小球藻的生長速率有一定抑制， 對最終的生物量和油含量影響不大。本研究發現，外施H2O2能夠顯著提高小球藻LS-2的Rubisco轉錄水平。因此，筆者推測之前報道的中低濃度活性氧之所以具備促進微藻生長的能力可能部分是由于其一方面提升了Rubisco的轉錄，另一方面由于濃度過低沒有達到對Rubisco蛋白產生毒害的程度，這樣使得Rubisco總量增加，從而增加了碳固定所造成的。

之前有研究推測，微藻在脅迫條件下油脂含量增加是可能是由于其碳固定途徑受抑制的同時，糖酵解途徑受到的影響不大，相應的糖酵解相對中間產物增多，這些產物為油脂合成提供了充足的底物[18-19]。本研究也表明，高濃度H2O2雖然能夠抑制卡爾文循環相關基因的轉錄，但提高了油脂合成途徑相關基因的轉錄，同時對于糖酵解途徑關鍵基因的轉錄影響不大，這些基因表達的數據支持該推測，證明了小球藻在高濃度H2O2的脅迫下，能夠抑制自身碳固定途徑，加強油脂合成途徑，從而更好地在外部逆境下生存。

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