氟環唑對映體絕對構型的確定及殘留分析方法研究

張春艷 劉志偉 茍高章 楊倩文 施海燕 王鳴華

摘 要 采用Lux Cellulose-1手性柱，建立了氟環唑對映體的反相高效液相色譜拆分方法。采用高效液相CD檢測器確定了氟環唑對映體的旋光性和流出順序，通過比較實測圓二色光譜圖與計算圓二色光譜圖，確定了氟環唑對映體的絕對構型。在此基礎上，建立了氟環唑對映體在蔬菜水果及土壤中的殘留分析方法，系統評價了方法的精密度、準確度、靈敏度和基質效應。在優化條件下，即以乙腈-水（60∶40，V/V）為流動相、流速0.6 mL/min、柱溫30℃、檢測波長220 nm，實現了氟環唑對映體的基線分離。手性柱上流出的第一個峰為（S，R）-（-）-氟環唑，第二個峰為（R，S）-（+）-氟環唑。在0.1～10.0 mg/L的濃度范圍內線性關系良好，無明顯基質效應。氟環唑對映體在6種基質中的平均回收率在80.8%～96.7%之間，日間相對標準偏差為1.5%～6.1%， 日內相對標準偏差為1.1%～6.7%； 方法的最小檢出量（LOD）為0.10～0.15 ng，定量限（LOQ）為0.05 mg/kg。本方法能滿足食品和環境樣品中氟環唑對映體的檢測要求。

關鍵詞 氟環唑； 對映體； 高效液相色譜； 絕對構型； 殘留分析

1 引 言

隨著手性技術的不斷發展，手性農藥已經成為手性技術發展過程中的一大亮點，國際市場中商品化的農藥中有30%是手性農藥[1～4]。手性農藥對映體通常具有相同的物理化學性質，但當手性農藥作用于生物體時，其對映體的生物活性及生物體內的吸收、分布、轉換、代謝以及毒性方面往往會存在較大差異[5～8]。如在三唑醇的4個對映體中，（1S，2R）的殺菌活性最高，而（1R，2S）和（1S，2S）的活性僅為（1S，2R）的1/70[9]。Huang等[10]研究了己唑醇的兩個對映體對水生生物斜生柵藻的急性毒性，結果表明（-）-對映體的毒性約為（+）-對映體的6倍。因此，從對映體水平研究手性農藥的活性、毒性以及環境行為等，能更合理更準確地對其進行評價。手性化合物絕對構型的確定以及分析方法的建立是系統研究手性農藥立體選擇性的基礎。確定絕對構型的方法主要有X射線單晶衍射法、基于手性試劑和NMR的Mosher法結合、有機合成法及光譜法等[11～14]。由于電子圓二色（ECD）光譜法對分子基團的空間取向非常敏感，能夠提供手性分子的三維結構信息，目前已成為探索手性分子空間絕對構型的有力工具。

氟環唑是一種內吸性三唑類殺菌劑，能抑制病菌麥角甾醇的合成，阻礙病菌細胞壁的形成。氟環唑具有殺菌廣譜、藥效高、低殘留、內吸性強、持效期長的特點，廣泛應用于小麥、水稻、油菜、大豆、蘋果、葡萄、咖啡、煙草等作物的病害防治。氟環唑分子中含有兩個手性中心，存在4個對映體，但商品化的氟環唑是順式結構，由兩個對映體組成。目前有關氟環唑對映體的研究主要為手性拆分方法，殘留分析方法的報道較少。Han等[15]使用Chiralcel OJ-H手性柱，在正相、反相及極性有機相多種模式下對氟環唑進行了拆分，并考察了不同流動相比例對拆分的影響； Qiu等[16]在纖維素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（Lux Cellulose-1）手性柱上用反相液相色譜基線分離了氟環唑； Tian等[17，18]建立了氟環唑在纖維素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相（CDMPC）或直鏈淀粉-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯） （ADMPC）上的反相液相色譜拆分方法； 趙悅臣等[19]利用超高效合相色譜-四極桿飛行時間質譜（UPC2-QTOF/MS），建立了順式-氟環唑在蘋果、葡萄和茶葉中的手性對映體拆分與殘留分析方法。而有關其對映體絕對構型的研究尚無報道。

本研究采用反相高效液相色譜結合Lux Cellulose-1手性柱對氟環唑對映體進行拆分，利用高效液相色譜CD檢測器確定其旋光性和對映體的流出順序，并通過比較實測和計算ECD光譜確定了氟環唑對映體的絕對構型，在此基礎上，建立了氟環唑對映體在土壤、黃瓜、蘋果、梨、葡萄和番茄6種基質中的殘留分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent-1200高效液相色譜儀（配VWD檢測器，美國Agilent公司）； CD-2095圓二色檢測器（日本Jasco公司）； J815圓二色光譜儀（日本Jasco公司）； R-200型旋轉蒸發儀（瑞士BUCHI公司）； CQ25-12D超聲波清洗機（寧波江南儀器制造廠）； TDL-40B臺式離心機（上海安亭儀器有限公司）； FA25勻漿機（德國Fluko公司）； MUL9000（A）-H-30型超純水系統（南京總馨純水設備有限公司）； Lux Cellulose-1手性色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，廣州菲羅門科學儀器有限公司）； Alumina-N、Cleanert Florisil、Cleanert-NH2 固相萃取柱（天津博納艾杰爾科技公司）。

氟環唑標準品（98.5%，上海安譜實驗科技股份有限公司）； 氟環唑對映體標準品（98.0%，上海勤路生物技術有限公司）； 乙腈（色譜純，美國Tedia公司）； 其它試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

2.2 實驗方法

2.2.1 流動相比例的確定 測定氟環唑在220～400 nm范圍內的吸收光譜，確定氟環唑的最大吸收波長為220 nm。利用Lux Cellulose-1手性色譜柱，在柱溫30℃、流速0.6 mL/min、檢測波長220 nm的條件下，考察不同流動相比例對氟環唑對映體拆分的影響。

2.2.2 氟環唑對映體流出順序與絕對構型的確定 采用高效液相CD檢測器，在優化的色譜條件下測定氟環唑外消旋體進樣時兩個峰的旋光性和流出順序。

使用J815圓二色光譜儀，在室溫條件下以100 nm/min的速度在200～400 nm范圍內對氟環唑對映體乙腈溶液掃描，重復3次，繪制出實測圓二色光譜圖（Electronic circular dichroism，ECD）。先將溶液中氟環唑對映體的優勢構象進行幾何優化，選用密度泛函理論（Density functional theory， DFT）B3LYP方法進行低能構象的結構優化。以對映體基態幾何結構為基礎，按電子吸收過程的垂直躍遷機制，利用含時密度泛函理論（Time-dependent DFT， TDDFT）中的Gaussian 09 計算方法[B3LYP/6-31+G*]，得到每個電子躍遷的激發態能量和轉動速度，再根據擬合公式模擬得到計算ECD譜圖，溶劑模型為乙腈PCM模型[20，21]。通過比較計算圓二色光譜和實測圓二色光譜確定氟環唑對映體的絕對構型。

2.2.3 樣品提取方法 （1）黃瓜、番茄、葡萄、蘋果：分別稱取20 g均質樣品于100 mL離心管中，加入40 mL乙腈，勻漿5 min，超聲20 min，4000 r/min離心5 min，取20 mL上清液，過無水Na2SO4，濃縮近干，待凈化。 （2）梨：稱取20 g均質樣品于三角瓶中，加入60 mL二氯甲烷，振蕩1 h，抽濾，過無水Na2SO4，濃縮近干，待凈化。（3）土壤：稱取10 g土壤樣品于50 mL離心管中，加入5 mL水和30 mL乙腈，渦旋10 min，超聲20 min，再加入3 g NaCl，渦旋1 min，4000 r/min離心5 min，取15 mL過無水Na2SO4，濃縮近干，待凈化。

2.2.4 凈化方法 Alumina-N SPE小柱先用6 mL正己烷預淋，再用8 mL正己烷分兩次溶解上樣，用10 mL正己烷：丙酮（95∶5， V/V）淋洗小柱，抽干小柱，10 mL二氯甲烷-正己烷（60∶40，V/V）洗脫，收集洗脫液，45℃濃縮至干，1 mL乙腈定容，過0.22 μm有機濾膜，待測。

2.3 方法驗證

2.3.1 基質效應 準確稱取氟環唑外消旋體標準樣品0.0102 g，用乙腈配制成1000 mg/L標準母液，再梯度稀釋成0.1～10.0 mg/L的系列標準工作溶液。根據2.2.3節和2.2.4節的提取和凈化方法制備空白基質樣品，分別使用0.1～10.0 mg/L標準工作溶液配制成基質標準溶液。在優化的儀器條件下進行測定，以標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，分別建立溶劑標準曲線和各基質匹配標準曲線。根據溶劑和基質標準曲線的斜率評價方法的基質效應。

2.3.2 準確度、精密度和靈敏度 在空白樣品中添加3檔濃度的氟環唑對映體標準溶液，添加濃度分別為0.05、0.5和1.0 mg/kg，每個添加濃度設5個重復，避光條件下放置8 h，按2.2節的方法提取凈化，計算回收率，評價其準確度和精密度，并分別考察方法的日間精密度和日內精密度。

2.4 對映體分離效果評價方法

手性化合物拆分中常用保留因子（Capacity factor， k′）、分離因子（Separation factor， ɑ）和分離度（Resolution， Rs）評價分離效果，計算公式如下：

式中，t0為系統死時間，由溶劑峰測定，測定的溶液一般是磷酸二氫鉀的鹽溶液，t為對映體色譜峰的保留時間，t1和t2為分別為兩個對映體的色譜峰保留時間，w1和w2為對映體峰寬。分離度Rs≥1.5時，兩個相鄰峰達到基線分離，標志著兩個峰已完全分離； 當Rs<1時，兩個峰之間有互相重疊的部分。

3 結果與討論

3.1 分離條件的優化

考察了不同比例的乙腈-水對氟環唑對映體拆分的影響，分離結果如表1所示，在流速為0.6 mL/min，流動相為55%～85%乙腈的條件下，隨著乙腈含量增加，保留時間逐漸縮短，t1從17.61 min減小到7.23 min， t2從30.13 min減小到9.88 min。在所有條件下，氟環唑對映體均能較好地實現分離，分離度在7.83～12.03之間。但在實際樣品檢測時，氟環唑對映體在乙腈-水（60∶40，V/V）中未受到雜質干擾，而在乙腈-水（70∶30，80∶20，V/V）等比例條件下，目標化合物均會受到樣品雜質的干擾。 因此， 選擇乙腈-水（60∶40，V/V）作為最佳流動相。此外，隨著流速增加，氟環唑對映體分離度變化不大，但對映體的響應值逐漸減小，故選擇流速為0.6 mL/min。

3.2 氟環唑對映體流出順序和絕對構型的確定

采用高效液相CD檢測器，在優化色譜條件下測定氟環唑外消旋體標準品的出峰順序（圖1）。結果表明，Lux Cellulose-1手性色譜柱上第一個被洗脫出的對映體為（-）-氟環唑，第二個峰為（+）-氟環唑，此流出順序與Zhang等[22]報道的結果一致。通過比較計算和實測ECD光譜圖（圖2），發現二者的變化趨勢一致。由此可知，圖1中第一個峰為（S，R）-（-）-氟環唑，第二個峰為（R，S）-（+）-氟環唑。

3.3 前處理方法的優化

考察了乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷3種對氟環唑溶解度較高的有機溶劑對不同基質中氟環唑提取效率的影響。結果表明，乙腈為提取溶劑時，土壤、黃瓜、番茄、葡萄、蘋果中氟環唑對映體的平均回收率在84.1%～91.2%之間，梨中的平均回收率低于73.8%； 二氯甲烷作為萃取劑時，梨中的添加回收率達到90.8%以上，而使用乙酸乙酯作為提取溶劑時，各種基質中氟環唑的回收率均偏低（64.2%～71.2%）。故針對不同基質，選擇最適的提取溶劑，以取得較高的回收率，即土壤、黃瓜、番茄、葡萄、蘋果選用乙腈作為提取溶劑，梨選用二氯甲烷作為提取溶劑。

蔬菜水果中一般含有大量色素、甾醇及糖類等雜質，會干擾目標化合物的檢測。固相萃取是凈化雜質常用方法之一， 本研究比較了Alumina-N、Cleanert Florisil和Cleanert-NH2 3種固相萃取柱（SPE）凈化效果。Cleanert-NH2 SPE小柱先用6 ml正己烷預淋，再用8 mL正己烷分兩次溶解上樣，用8 mL正己烷-丙酮（95∶5，V/V）淋洗小柱，10 mL正己烷-丙酮（90∶10，V/V）洗脫小柱； Cleanert Florisil SPE小柱先用6 ml正己烷預淋，再用8 mL正己烷分兩次溶解上樣，用8 mL正己烷淋洗小柱，10 mL正己烷-丙酮（90∶10，V/V）洗脫小柱； Alumina-N的凈化條件見2.2.4節。結果表明，Cleanert-NH2 SPE回收率較低（<60%）； Alumina-N SPE和Cleanert Florisil SPE均能達到回收率要求，而Alumina-N SPE的凈化效果優于Cleanert Florisil SPE。因此，選取Alumina-N SPE作為氟環唑在各基質中的凈化小柱。

3.4 基質效應

氟環唑對映體在溶劑和各基質中的回歸方程和基質效應見表2。在0.1～10.0 mg/L濃度范圍內，溶劑標準曲線和基質標準曲線的線性關系良好，R2>0.9998。分析結果表明，基質斜率與溶劑斜率之比在0.99～1.01之間，說明氟環唑在各基質中沒有明顯的基質效應，可采用溶劑標準曲線進行定量檢測。 （S，R）-（-）-氟環唑的線性回歸方程為y=78.829x-1.2522（R2=0.9998）； （R，S）-（+）-氟環唑的線性回歸方程為y = 79.12x-1.4583（R2=0.9999）。二者的線性范圍均為0.1～10.0 mg/L， 圖3添加0.05 mg/kg氟環唑外消旋體的土壤樣品典型色譜圖。

3.5 準確度、精密度和靈敏度

氟環唑在6種基質中的添加回收實驗結果（表3）表明，（S，R）-（-）-氟環唑在各基質中的平均回收率在80.8%～96.7%之間，日間相對標準偏差（RSD）為1.5%～6.1%，日內RSD為11%～62%； （R，S）-（+）-氟環唑在各基質中的平均回收率在824%～935%之間，日間RSD為27%～59%，日內RSD為22%～67%。方法的定量限（LOQ）為0.05 mg/kg，最小檢出量（LOD）為0.10～0.15 ng。根據《食品安全國家標準》（GB 2763-2016），氟環唑在蘋果和葡萄中的最大殘留限量（Maximum residue limit，MRL）為0.5 mg/kg，本方法的LOQ為MRL值的1/10，且方法的準確度和精密度均滿足農藥殘留試驗準則（NY/T 788-2004）的相關要求，可用于實際樣品的檢測。與文獻[22]（LOD≤1.4 μg/kg，LOQ≤4.7 μg/kg）相比，本方法靈敏度較低，但能滿足實際樣品的檢測要求，可為氟環唑對映體選擇性研究提供參考。

4 結 論

利用HPLC結合Lux Cellulose-1手性色譜柱對氟環唑對映體進行了拆分，確定了最佳拆分條件。通過高效液相CD檢測器確定了氟環唑對映體的流出順序，通過比較實測與計算ECD結果確定了氟環唑對映體的絕對構型。從手性柱上第一個被洗脫出來的峰為（S，R）-（-）-氟環唑，第二個被洗脫出來的峰為（R，S）-（+）-氟環唑。與傳統的構型確定方法相比，計算化學確定手性化合物的絕對構型更加方便快捷，且具有很高的可信度和準確性[23]。在此基礎上，建立了氟環唑對映體在蔬菜水果及土壤中的殘留分析方法，氟環唑對映體在0.1～10.0 mg/L范圍內線性關系良好，本方法無基質效應。方法的平均回收率為80.8%～96.7%，日間RSD在1.5%～6.1%之間，日內RSD在1.1%～6.7%之間； 定量限（LOQ）為0.05 mg/kg。本研究為食品和環境中氟環唑對映體的定量測定提供了一種快速、準確的方法，為系統評價手性殺菌劑氟環唑的立體選擇性和安全性提供了參考。

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