ε—聚賴氨酸對尿液中常見細菌的體外抑菌效果及對尿蛋白測定影響的研究

郭國威 許堅鋒 陳錦文

【摘要】 目的：了解ε-聚賴氨酸（ε-Poly-L-lysine，ε-PL）對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌及銅綠假單胞菌等四種尿液中常見細菌的體外抑菌效果，并探討其對尿蛋白測定的影響。

方法：使用肉湯稀釋法將ε-PL倍比稀釋后加入等量細菌懸液中，于35 ℃溫箱內24 h后觀察ε-PL對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC）。同時將不同濃度的ε-PL加入尿液中，分析其對尿蛋白測定的干擾。結果：ε-PL溶液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌及銅綠假單胞菌等尿液中常見細菌的體外抑菌均有明顯效果，MIC分別為0.02、0.01、0.04及0.01 mg/mL，其中ε-PL對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌效果最好；原尿液、加蒸餾水尿液中尿蛋白含量比較，差異無統計學意義（P>0.05）；含不同濃度ε-PL尿液標本中尿蛋白含量均明顯高于原尿液，比較差異均有統計學意義（P<0.05），且隨著尿液中ε-PL濃度的增加對蛋白測定的影響就越大。結論：ε-PL能有效抑制尿液常見細菌的生長，能用于尿液樣本防腐，但不適用于24 h尿蛋白測定標本的防腐。

【關鍵詞】 ε-聚賴氨酸； 最小抑菌濃度； 尿蛋白； 干擾

【Abstract】 Objective：To understand the in vitro bacteriostatic effect of ε-Poly-L-lysine（ε-PL） on four common bacteria in urine，including Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa，and to explore its influence on urinary protein determination.Method：The broth dilution method was used to dilute the ratio of ε-PL and add the same amount of bacterial suspension.The MIC of ε-PL to Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa was observed after 24 hours in the incubator at 35℃.At the same time，different concentrations of ε-PL were added into the urine to analyze the interference of urine protein determination.Result：Solution ε-PL has obvious bacteriostatic effect on common bacteria in urine，such as Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa，MIC were 0.02，0.01，0.04 and 0.01 mg/mL respectively，among them，ε-PL had the best bacteriostatic effect on Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa.The urine protein in original urine and urine added with distilled water was compared，the differences was not statistically significant（P>0.05）.The urine protein in urine samples containing different concentrations of ε-PL were significantly higher than those of original urine，the differences were statistically significant（P<0.05），and the higher the concentration of ε-PL in urine，the greater the effect on the determination of protein.Conclusion：ε-PL can effectively inhibit the growth of common bacteria in urine，and can be used for the preservation of urine samples，but not for the preservation of 24 hours urine protein test specimens.

【Key words】 ε-Poly-L-lysine； MIC； Urine protein； Interference

First-authors address：Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine Zhuhai Hospital，Zhuhai 519015，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.33.038

ε-聚賴氨酸（ε-Poly-L-lysine，ε-PL）是1977年由日本科學家在放線菌培養過濾液中發現的一種新型天然防腐劑，是由25～30個賴氨酸殘基的同型單體聚合物組成，賴氨酸通過α-羧基和ε-氨基形成的酰胺鍵連接在一起而成[1]。ε-PL是由微生物分泌的、具廣譜抗微生物活性的多肽性類物質，易被生物降解，對人體無害，目前廣泛應用于食品防腐中[2]。尿液樣本在常溫下長時間存放會有細菌生長從而影響尿液某些成分發生改變而影響檢驗結果，為了保證檢測結果的準確性，通常采用加入防腐劑的方法來抑制細菌生長。目前尿24 h蛋白測定常采用甲苯作為防腐劑，但甲苯對人體有致癌作用，探索新的尿24 h蛋白標本防腐劑具有重要意義。為此，本研究通過ε-PL對尿液中常見菌的抑菌效果，并探索其對尿蛋白測定的影響，驗證ε-PL作為尿液防腐劑的可能性。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC218531及糞腸球菌ATCCA29212均由法國梅里埃公司提供。

1.2 儀器與試劑 9 mm血培養基由廣州迪景公司提供；比濁儀由法國梅里埃公司提供；隔水式電熱恒溫培養箱由上海躍進醫療器械有限公司提供；ε-PL購于鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；VITROS350干式生化分析儀及尿蛋白試劑由美國強生公司提供。

1.3 方法

1.3.1 ε-PL培養液的配制 稱取適量ε-PL，溶解于無菌生理鹽水中，配制成ε-PL防腐劑原液25.6 mg/mL備用。取無菌試管12支（按順序標記），除第1管外，每管加入尿液1 mL；先吸取防腐劑原液2 mL加入第1管中，再從第1管中吸取1 mL防腐劑原液加入第2管中，混勻后吸出1 mL加入第三管中，依次類推至第12管后，吸出1 mL棄去。這樣各管中防腐劑的濃度依次為：25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0.003 125 mg/mL。每12管為一組并做好標記，一共設置4組分別對應4種受試菌株。另每組設“尿液對照”和“測試菌生長對照”各一管。

1.3.2 接種細菌及細菌培養 分別挑取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌制備0.5麥氏單位的受試菌液，取150 μL菌液加入15 mL新鮮無菌尿液中，混勻，取1 mL依次加入12支試管中，混勻，則得到ε-PL最終濃度依次為1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25、0.000 625 mg/mL的培養基。對照管不加菌液，測試菌生長對照管不加防腐劑。將上述處理的不同濃度ε-PL培養基放置室溫中24 h后轉種至血平板，35 ℃培養箱培養16～20 h后觀察結果。

1.3.3 含不同ε-PL濃度的尿液配制及蛋白濃度測定 收集正常尿液混勻備用（干化學試紙陰性），將混合尿液分成7組，每組樣本量為10 mL：第1組原尿10 mL，第2組9 mL原尿+1 mL蒸餾水，其余5組9 mL原尿分別加入1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 mg/mL的ε-PL溶液1 mL，使其最終尿液ε-PL混合液中ε-PL濃度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL。采用鄰苯二酚紫染料結合比色法，使用VITROS350強生干式生化分析儀對各溶液中的蛋白濃度進行檢測，每組測定三次取平均值。

1.4 統計學處理 使用SPSS 20.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ε-PL對尿液常見菌的抑菌情況 用倍比肉湯稀釋法測得ε-PL對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌均有抑菌效果，最小抑菌濃度（MIC）分別為0.02、0.01、0.04及0.01 mg/mL，其中ε-PL對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌效果最好。見表1。

2.2 不同濃度的ε-PL溶液對尿蛋白測定的影響 采用VITROS350干式生化分析儀對混有不同濃度ε-PL的尿液標本進行尿蛋白測定，原尿液蛋白含量為（96.36±1.26）mg/L，加蒸餾水尿液中尿蛋白含量為（95.60±1.22）mg/L，與原尿液尿蛋白含量比較差異無統計學意義（t=0.615，P=0.310）；而含0.01、0.02、0.04、0.08及0.16 mg/mL不同ε-PL濃度尿液標本中尿蛋白含量分別為（122.30±2.20）、（146.90±1.30）、（177.93±0.15）、（341.30±2.40）及（695.70±7.47）mg/L，均明顯高于原尿液，比較差異均有統計學意義（t=3.063、4.190、5.522、6.924、9.217，P=0.041、0.036、0.023、0.015、0.006），且隨著尿液中ε-PL濃度的增加對蛋白測定的影響就越大。

3 討論

腎臟作為人體調節物質代謝的重要樞紐，機體每天生理排泄一定尿液及尿液中各類物質尿液成分變化能反映腎小球和腎小管功能，檢測尿液量和尿蛋白含量對腎功能，診斷治療和預后判斷都有一定的臨床意義[3-4]。24 h尿蛋白定量也稱為24 h尿蛋白排泄率，是通過收集24 h的全部尿液，來測定其中的蛋白質的含量，進而計算出24 h內的蛋白總量，因此可以準確地反映患者一天之中蛋白質丟失的情況。正常人的腎小球濾液中存在小分子量的蛋白質，在通過近曲小管時絕大部分又被重吸收，因此終尿中的蛋白質含量<150 mg/24 h。當尿中蛋白質超過正常范圍時，稱為蛋白尿，是腎臟疾病常見的臨床表現，一些全身性疾病亦可出現蛋白尿[5-6]。尿液樣本在常溫下長時間存放會有細菌生長從而影響到尿液某些檢測項目的結果，通常采用加入防腐劑的方法來抑制細菌生長。目前常用尿液24 h蛋白測定常用防腐劑為甲苯，雖然能起到尿液防腐作用，但長期使用會對患者或檢驗人員產生一定傷害[7-8]。因此，尋找安全可替代尿液防腐劑是目前研究的熱點問題。

ε-PL是一種由賴氨酸單體通過ε-氨基和α-羧基形成酰胺鍵聚合而成的均聚物[9-10]，具獨特功能的多肽結構，也是一種生物堿，具有廣譜抗菌活性[11]、抗噬菌體活性、安全性高、水溶性和熱穩定性好等特點，且易被生物降解，對人體無毒害，通常用作食品防腐劑[12-14]。ε-PL抑菌機制主要是將細菌細胞壁逐步破壞，從而使得堿性磷酸酶滲出，破壞細菌細胞膜的完整性，使其在細胞膜上形成穿孔并喪失其生理功能，先導致小分子物質滲出，使得胞外離子含量升高，當細胞膜發生崩解時大分子物質溢出，影響細胞內外蛋白質的合成，最終導致細胞死亡，起到抑菌作用[15-16]。本研究結果顯示，當尿液中ε-PL濃度達到0.04 mg/mL及以上時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌及銅綠假單胞菌等四種尿液中常見細菌均有抑菌作用，即0.04 mg/mL為尿液中最佳抑菌濃度，為尿液防腐的用量提供一定參考理論依據，與李宇雄等[17]報道相一致，這正說明了ε-PL溶液可用于尿液的防腐，且效果明顯、安全。

目前臨床實驗室24 h尿蛋白定量檢測主要采用染料結合法，其具有靈敏度高、重復性好、操作簡便、快速、可自動化的特點[5-6]。本研究采用鄰苯二酚紫染料結合比色法來檢測ε-PL溶液對24 h尿蛋白測定結果的影響，結果顯示，原尿液、加蒸餾水尿液中尿蛋白含量比較差異無統計學意義（P>0.05）；而含0.01、0.02、0.04、0.08及0.16 mg/mL不同ε-PL濃度尿液標本中尿蛋白含量均明顯高于原尿液，比較差異均有統計學意義（P<0.05），且隨著尿液中ε-PL濃度的增加對蛋白測定的影響就越大。提示當尿液中ε-PL溶液濃度達到0.01 mg/mL時就對尿蛋白測量結果產生明顯干擾，且干擾程度隨著尿液中ε-PL溶液濃度的增加而增加，這除了可能與ε-PL結構中存在大量的賴氨酸殘基可與染料結合從而干擾測定有關[18]，也可能與ε-PL富含陽離子，易與帶有陰離子的物質有強的靜電作用力結合有關[19-20]。

綜以上述，ε-PL濃度達到0.04 mg/mL及以上對尿液中常見細菌均有明顯抑菌作用，但當ε-PL濃度達到0.01 mg/mL時對尿蛋白測定就產生明顯干擾現象。因此ε-PL溶液可用于尿液的防腐，但不能用于尿蛋白測定的尿液防腐。

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（收稿日期：2018-09-11） （本文編輯：董悅）