Tubacin對慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激模型大鼠的抗抑郁作用及其作用機(jī)制研究

孫國平　李昆　盧豪忠

[摘要] 目的 探討組蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）選擇性抑制劑tubacin對慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（CUMS）模型大鼠的抗抑郁作用及其可能的作用機(jī)制。 方法 將50只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為五組（n = 10）：對照組（A組），CUMS模型組（B組），氟西汀處理組（C組），tubacin處理組（D組），氟西汀聯(lián)合tubacin處理組（E組）。應(yīng)用Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)及空間探索試驗(yàn)測試大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶情況。采用還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒檢測各組大鼠血清中GSH水平。 結(jié)果 Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)顯示，與A組比較，B組大鼠平均逃避潛伏期顯著延長（P < 0.05或P < 0.01）；與B組比較，C、D、E組平均逃避潛伏期明顯縮短（P < 0.05或P < 0.01），且E組平均逃避潛伏期顯著短于C組和D組（P < 0.05或P < 0.01）。在空間探索試驗(yàn)中，C、D、E組大鼠在第三象限的停留時間明顯長于其他三個象限（P < 0.05或P < 0.01），E組大鼠在第三象限的停留時間明顯長于C組和D組（P < 0.05或P < 0.01）。B組大鼠血清GSH水平明顯低于A組（P < 0.05），C組血清GSH水平顯著高于B組（P < 0.05），E組血清GSH水平較C組進(jìn)一步提高（P < 0.05），并且與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力與血清GSH水平顯著相關(guān)（P < 0.05）。 結(jié)論 HDAC6選擇性抑制劑tubacin可通過調(diào)節(jié)血清GSH水平以提高大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力，從而發(fā)揮抗抑郁作用。

[關(guān)鍵詞] 抑郁癥；組蛋白去乙酰化酶；Tubacin；還原型谷胱甘肽；慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激

[中圖分類號] R749.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（a）-0013-05

[Abstract] Objective To investigate the antidepressant effects of histone deacetylase 6 （HDAC6） selective inhibitor tubacin for the model rats with chronic unpredictable mild stress （CUMS） and its mechanism. Methods Fifty male adult rats were randomly divided into 5 groups （n = 10）： control group （group A）， CUMS model group （group B）， Fluoxetine treatment group （group C）， tubacin treatment group （group D） and combination of Fluoxetine and tubacin treatment group （group E）. The spatial learning and memory abilities of rats were tested by orientation navigation experiment and spatial probe trial of Morris water maze. Meanwhile， the levels of serum reduced glutathione （GSH） in all groups were measured by GSH kits. Results The orientation navigation experiment of Morris water maze showed that compared with group A， the mean escape latency of rats in group B was significantly lengthened （P < 0.05 or P < 0.01）， compared with group B， the mean escape latency of rats in group C， D， E was significantly shortened （P < 0.05 or P < 0.01）， and the mean escape latency of rats in group E was significantly shorter than those of group C， D （P < 0.05 or P < 0.01）. In the spatial probe trial， the length of stay in the third quadrant of group C， D， E was significantly longer than those of the left three quadrants （P < 0.05 or P < 0.01）， the length of stay in the third quadrant of group E was significantly longer than those of group C， D （P < 0.01， P < 0.05）. The level of serum GSH in group B was significantly lower than that of group A （P < 0.05）， while the level of serum GSH in group C was significantly higher than that of group B （P < 0.05）， the level of serum GSH in group E was significantly higher than that of group C （P < 0.05）， there was no statistically significant difference between group E and group A （P > 0.05）. Correlation analysis showed that the spatial learning and memory abilities of rats were significantly correlated with the level of GSH （P < 0.05）. Conclusion HDAC6 selective inhibitor tubacin can improve the spatial learning and memory abilities of rats by regulating the levels of GSH， so as to play antidepressant effects.endprint

[Key words] Depression； Histone deacetylase； Tubacin； Reduced glutathione； Chronic unpredictable mild stress

近年來抑郁癥的發(fā)病率不斷上升，引起的社會問題日益嚴(yán)重[1]。藥物治療是目前治療抑郁癥的主要手段[2-3]。盡管現(xiàn)有抗抑郁藥物眾多，但均存在起效慢、復(fù)發(fā)率高等缺陷，而且臨床上存在大量的患者對抗抑郁藥治療反應(yīng)不佳[4-6]。一項(xiàng)大樣本回顧性研究發(fā)現(xiàn)，75%～80%的抑郁癥患者在抗抑郁治療過程中存在復(fù)發(fā)現(xiàn)象[7]。因此尋找新的有效藥物成為抗抑郁治療中亟需解決的問題。

表觀遺傳調(diào)控研究的深入為抗抑郁治療開辟了新道路，有望成為解決上述問題的突破口。組蛋白的乙酰化修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要方式，有研究表明，組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）在抗抑郁治療中起著重要作用[8-9]。組蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）是HDACs家族的一員，研究證實(shí)，HDAC6在精神類疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，并且抑郁癥患者血清中也存在HDAC6表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象[10]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，HDAC6選擇性抑制劑tubacin（tubulin acetylation inducer）能夠通過調(diào)控還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）水平發(fā)揮顯著的抗精神分裂及抗神經(jīng)退行性疾病作用[11-12]。然而，tubacin能否產(chǎn)生抗抑郁作用尚無報(bào)道。因此，本研究采用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型大鼠，研究tubacin對慢性應(yīng)激大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶及血清GSH水平的影響，旨在明確tubacin的抗抑郁作用以及其產(chǎn)生抗抑郁作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

成年雄性SD大鼠，（200±20）g，7～9周齡，清潔級。由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動物中心提供（合格證號：中科動管第003號）。

1.2 試劑

氟西汀及tubacin購于美國Sigma公司，GSH檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)動物分組及給藥 將健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為五組（n = 10）：對照組（A組，給予生理鹽水灌胃），CUMS模型組（B組，采用不同應(yīng)激因子交替刺激加孤養(yǎng)復(fù)制CUMS模型，并給予生理鹽水灌胃），氟西汀處理組（C組，采用不同應(yīng)激因子交替刺激加孤養(yǎng)復(fù)制CUMS模型，并給予氟西汀灌胃），tubacin處理組（D組，采用不同應(yīng)激因子交替刺激加孤養(yǎng)復(fù)制CUMS模型，并給予tubacin灌胃），氟西汀聯(lián)合tubacin處理組（E組，采用不同應(yīng)激因子交替刺激加孤養(yǎng)復(fù)制CUMS模型，并給予氟西汀+tubacin灌胃），應(yīng)激前10 min，灌胃給藥，共4周。氟西汀的用藥劑量為10 mg/kg，tubacin用藥劑量為3 mg/kg，溶劑為生理鹽水。

1.3.2 CUMS抑郁模型的建立 正常對照組每籠5只飼養(yǎng)，正常飲水進(jìn)食，不給予任何刺激。其余各組采用CUMS結(jié)合孤養(yǎng)方法建立大鼠抑郁模型。CUMS包含以下7種不同的刺激因子：①禁食24 h；②禁水24 h；③高速水平震蕩5 min；④晝夜顛倒；⑤4℃冷刺激5 min；⑥45℃熱刺激5 min；⑦夾尾5 min，每日隨機(jī)給予一種應(yīng)激刺激，相同刺激不連續(xù)出現(xiàn)。

1.3.3 空間學(xué)習(xí)、記憶能力觀察 大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力將利用Morris水迷宮試驗(yàn)進(jìn)行測定，造模結(jié)束后，進(jìn)行空間搜索試驗(yàn)及定位航行試驗(yàn)兩個部分。水迷宮水池被均等劃分為4個象限，并將第三象限劃分為目標(biāo)象限。①定位航行試驗(yàn)：首先將大鼠置于水迷宮平臺上進(jìn)行適應(yīng)20 s，隨后，隨機(jī)將大鼠從除目標(biāo)象限外的其他不同象限置入水池，直到大鼠爬上平臺后終止記錄，如若120 s內(nèi)大鼠依舊無法上臺，則人為引導(dǎo)其爬上平臺適應(yīng)10 s，最后，將大鼠烘干放入鼠籠。定位航行訓(xùn)練共計(jì)5 d。記錄大鼠平均上臺（逃避）潛伏期，以評判其空間學(xué)習(xí)能力。②空間探索試驗(yàn)：在定位航行試驗(yàn)結(jié)束1 d后撤除水池中的平臺，隨后，將大鼠從除目標(biāo)象限外的其他不同象限置入水池，大鼠在120 s內(nèi)的游泳軌跡將被記錄，用以測量大鼠在目標(biāo)象限的游泳時間，以評估其記憶能力。

1.3.4 血清GSH水平的檢測 各組大鼠在最后1次給藥24 h后從內(nèi)眥采取靜脈血，離心分離出血清，保存于-80℃冰箱待測。血清中GSH的含量檢測將嚴(yán)格按照檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠在定位航行試驗(yàn)中的平均逃避潛伏期

隨著CUMS造模試驗(yàn)的推進(jìn)及水迷宮試驗(yàn)次數(shù)的增多，各組大鼠的平均潛伏期呈現(xiàn)遞減的趨勢。其中，與A組比較，B組大鼠平均逃避潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），提示CUMS模型對大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力產(chǎn)生了較明顯的損害；與B組比較，C、D組大鼠平均逃避潛伏期顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），提示tubacin改善了CUMS模型鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力；與C、D組比較，E組大鼠逃避潛伏期進(jìn)一步減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），提示tubacin與氟西汀聯(lián)用對改善抑郁模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力起協(xié)同作用。見圖1。

2.2 大鼠在空間探索試驗(yàn)中各象限停留的時間

空間探索試驗(yàn)結(jié)果顯示，B組大鼠水迷宮第三象限停留時間顯著短于A組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），見圖2A；C、D、E三組大鼠在第三象限的停留時間明顯長于其他3個象限（P < 0.05或P < 0.01），見圖2B～D，提示CUMS造模損傷了大鼠的空間記憶能力，并破壞其空間定位準(zhǔn)確性，給藥tubacin或氟西汀后，應(yīng)激組大鼠空間記憶的保持能力有較好的恢復(fù)；且E組大鼠在第三象限停留時間明顯長于C、D組（P < 0.01、P < 0.05），提示tubacin與氟西汀合用對大鼠空間記憶力的恢復(fù)作用強(qiáng)于單用tubacin或氟西汀，見圖2E。endprint

2.3 各組大鼠血清GSH水平比較

B組血清GSH水平顯著低于A組（P < 0.05），提示抑郁癥大鼠血清存在GSH水平下調(diào)現(xiàn)象，C組血清GSH水平較B組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。D組血清GSH水平與B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。E組大鼠血清GSH水平較C組進(jìn)一步升高（P < 0.05），且E組的大鼠血清GSH水平幾乎恢復(fù)到正常（A組）水平（P > 0.05），提示tubacin可能通過提高血清GSH水平進(jìn)而發(fā)揮其抗抑郁活性，而氟西汀能夠加強(qiáng)tubacin的GSH調(diào)控能力。見圖3。

2.4 抑郁大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力與血清GSH水平的相關(guān)性

給予抑郁癥模型大鼠tubacin和/或氟西汀處理，從行為學(xué)觀察B組為抑郁模型狀態(tài)，而C、D、E組抑郁癥狀明顯改善。然而，D組大鼠血清GSH水平與B組比較并未發(fā)生明顯改變（圖3）。因此，把C、E組的水迷宮行為學(xué)測試結(jié)果和血清GSH水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示C、E兩組逃避潛伏期、平臺象限游泳時間與血清GSH水平具有顯著相關(guān)性（R2 = 0.8498、0.8846、0.8652、0.8237，均P < 0.05）。見圖4。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，tubacin及氟西汀能夠改善抑郁應(yīng)激模型大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。氟西汀是選擇性5-羥色胺（5-HT）回收抑制劑，間接性增加大腦自身的5-HT水平，緩解5-HT缺乏狀態(tài)，進(jìn)而對抑郁癥的相關(guān)癥狀產(chǎn)生治療作用[13]。tubacin作為HDAC6選擇性抑制劑在本研究中發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗抑郁作用，但弱于氟西汀[14]。進(jìn)一步研究證實(shí)，tubacin和氟西汀合用能夠產(chǎn)生協(xié)同抗抑郁作用，國內(nèi)外文獻(xiàn)鮮見此類報(bào)道，可以為抑郁癥的治療提供新的思路。

以記憶減退為特征的認(rèn)知功能損害已成為多數(shù)抑郁癥患者的主要癥狀。研究表明，組蛋白的乙酰化修飾作為染色質(zhì)重塑的方式之一，也參與了記憶的形成，尤其是海馬依賴性的記憶[15]。有研究報(bào)道，HDAC1和HDAC6與抑郁癥記憶、認(rèn)知關(guān)系不大，而HDAC3與記憶、認(rèn)知具有相關(guān)性[16]。HDAC6在抑郁癥患者血清中高表達(dá)可能是調(diào)控了抑郁癥的其他癥狀，如睡眠障礙、情感障礙。本研究發(fā)現(xiàn)tubacin的抗抑郁作用與血清GSH水平具有顯著相關(guān)性，但尚不能證實(shí)tubacin是否通過抑制HDAC6表達(dá)從而改善抑郁癥癥狀。

GSH是衡量體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)。氧化應(yīng)激與內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)功能的減退在抑郁癥的發(fā)生中起著重要的作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激因直接或間接造成機(jī)體GSH水平降低及促氧化物酶活性增加而成為抑郁癥氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要原因[18-19]。抑郁癥患者血清GSH水平與抑郁癥嚴(yán)重程度、自殺傾向強(qiáng)度密切相關(guān)[20]。本研究顯示，抑郁癥模型大鼠血清中GSH水平明顯低于對照組，用藥氟西汀后并不能顯著提高大鼠血清內(nèi)GSH水平，而tubacin明顯提高了抑郁模型大鼠血清中GSH水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，氟西汀能夠加強(qiáng)tubacin的GSH水平調(diào)控作用。研究證實(shí)了抑郁癥大鼠存在血清GSH水平降低現(xiàn)象，驗(yàn)證了tubacin通過調(diào)控GSH水平改善抑郁癥狀的作用，豐富了抑郁癥的機(jī)制研究思路。然而，tubacin是通過何種途徑調(diào)控了體內(nèi)GSH水平，該調(diào)控作用是否與HDAC6表達(dá)相關(guān)還遠(yuǎn)未闡明。

綜上所述，本研究提示tubacin可通過調(diào)控體內(nèi)GSH水平產(chǎn)生抗抑郁作用，并且，tubacin與氟西汀抗抑郁作用具有協(xié)同性，氟西汀能夠加強(qiáng)tubacin的GSH水平調(diào)控作用。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清GSH水平與抑郁癥癥狀顯著相關(guān)。因缺乏相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道和試驗(yàn)依據(jù)，兩藥共用產(chǎn)生一系列作用的機(jī)制尚不清楚。但是，本研究為抑郁癥的藥物治療提供了新的思路，也為抗抑郁癥藥物開發(fā)提供了新的研究方向。

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（收稿日期：2017-07-19 本文編輯：張瑜杰）endprint