探究pH對酶活性的影響的實驗改進與延伸

程宏??

摘要：對“pH對酶活性的影響”探究實驗的實驗材料、實驗原理、實驗方案、操作步驟、實驗拓展的充分思考與設計更有利于探究活動的科學、開放和深入。

關鍵詞：pH；酶活性；過氧化氫；過氧化氫酶

研究背景

影響酶活性的條件很多，其中“pH對酶活性的影響”就是高中生物中學生需要探究的一個主題。如果僅僅按照常規的教學安排，將使得探究實驗成為驗證實驗或者僅僅是操作技術的模仿。如何使得整個探究活動更為科學、開放和深入呢？筆者在實際的教學中有以下探究與思考：

教學設計

一、 課前分組設計“探究pH對酶活性的影響”實驗方案

實驗材料：過氧化氫溶液、過氧化氫酶溶液（動植物組織提取液）、淀粉溶液、淀粉酶溶液。

實驗器材：滿足方案需求。

二、 課上分組交叉討論實驗方案，關注以下幾個主題

1. 選擇什么樣的實驗材料更合適？

實驗中需要加入鹽酸和氫氧化鈉以調節pH值，那么毫無疑問，需要考慮pH（酸堿度）對反應底物分解的影響，按照教材中的建議，“用過氧化氫酶探究pH對酶活性的影響”而不采用“淀粉酶”。原因是淀粉會在酸性條件下進行水解，從而影響實驗結果，干擾對實驗結果的分析，無法作出“pH對酶活性影響”的相關結論。

2. 如何設定合適的梯度區間？

那么，使用過氧化氫酶（CAT）探究pH對酶活性的影響是不是就不用考慮pH對過氧化氫分解的影響了呢？教師演示實驗：向過氧化氫溶液中添加強酸強堿，觀察現象。

過氧化氫是一種二元弱酸，金屬過氧化物是它的正鹽。

實驗室制取過氧化氫就是利用強酸制弱酸原理：

H2SO4+BaO2H2O2+BaSO4↓

過氧化氫在強酸性條件下（pH<3）穩定性較差，表現很強的氧化性，能夠使得蛋白質分子的氨基酸殘基被氧化。如，半胱氨酸的巰基容易被氧化，如果酶的活性位點是半胱氨酸，氧化后則失活，如果其他位置的半胱氨酸被氧化，則形成其他二硫鍵影響蛋白質的空間結構。

過氧化氫在弱酸條件下比較穩定，一般商品的過氧化氫溶液里都加有酸作為穩定劑，它的pH值約在4左右。當pH值在5～7時，其分解有所加快。

過氧化氫在強堿性條件下不穩定，表現為還原性，分解速度加快。因為在此條件下，容易形成HO-2離子。而HO-2是一種親核試劑，會繼續引發過氧化氫分解。其反應如下：

H2O2H++HO-2

當pH>11時過氧化氫分子大部分以過氧氫陰離子（HO-2）形式存在，所以此時溶液的穩定性很差，且隨著pH值的升高，穩定性下降，分解速度更快。

因此，如果用過氧化氫酶探究pH對酶活性的影響就需要對pH的范圍進行設定，不要過酸或者過堿，從而針對性地探究出pH對酶活性的影響。

3. 用三種實驗操作方法的差別到底是控制無關變量還是自變量？

搜集學生的實驗設計方案，分析比較各方案的差異：

方案一：向3支盛有酶溶液的試管中加入已經稀釋待用的鹽酸溶液（pH為4、5、6）2mL，充分混勻后，各自加入2mL過氧化氫溶液，振蕩，觀察比較氣泡的產生速率。

方案二：先將酶溶液加入過氧化氫溶液中，在酶和底物的反應體系中快速加入已經稀釋待用的鹽酸溶液（pH為4、5、6）2mL，振蕩，觀察比較氣泡的產生速率。

方案三：向3支盛有酶溶液的試管和3支盛有底物溶液的試管中分別加入已經稀釋待用的鹽酸溶液（pH為4、5、6）2mL，充分混勻后，將兩支試管的內容物混合在一起，觀察比較氣泡的產生速率。

對于方案一來說，雖然過氧化氫酶被不同pH處理過，但是當過氧化氫酶溶液與過氧化氫溶液混合時，pH已經明顯發生改變。在未知pH對酶活性影響是否具有可逆性時，這種做法是違背控制性原則的。

由于酶具有高效性，方案二中，氣泡的產生速率很快，加入不同pH的鹽酸溶液已經看不出明顯差異。

只有方案三，由于底物與酶分別處理，所以很好地控制了pH誤差，pH是本實驗的自變量，而不是無關變量。操作方法體現了實驗者對實驗自變量的操控而不是對無關變量的控制。

三、 課堂分組實施實驗方案，圍繞操作與裝置提出問題

1. 可以用梯度稀釋法配制不同pH的鹽酸溶液

借鑒微生物分離純化與計數中的“梯度稀釋”方法可以獲得不同濃度梯度NaOH溶液和HCl溶液，具體方法是：用微量移液器吸取1mL的濃鹽酸，加入盛有11mL蒸餾水的1號試管中，振蕩混勻，此時溶液pH為3；更換槍頭，在1號試管中吸取1mL的溶液，加入盛有9mL蒸餾水的2號試管中，振蕩混勻，此時溶液pH為4；以此類推可以配制溶液pH為5、6的鹽酸溶液（注意不能配制得到pH為7的溶液，直接使用蒸餾水）。

2. 反應的觀測指標是什么？酶促反應速率就是酶活性嗎？

無論是觀察氣泡的釋放速度，還是觀察有色液滴的移動距離，以這些為標準，衡量酶促反應速率。但是酶促反應速率并不等同于酶活性。酶活性是酶的一個屬性，影響酶活性的因素一定影響酶促反應速率，比如溫度、pH、非競爭性抑制劑。反之，影響酶促反應速率的因素不一定影響酶活性，比如酶濃度、底物濃度。

四、 課后反思實驗拓展

1. 這個實驗究竟能不能找到“最適”呢？

嚴格地說，通過具體的實驗是不能夠找到所謂“最適”的，即使很小的梯度范圍。但是，我們可以確定“通過該實驗得到的最適”或者“最適的區間”。

2. 為什么肝臟研磨液可以催化過氧化氫的分解呢？

在真核細胞中普遍存在著過氧化物酶體（微體），在肝細胞和腎細胞中數量特別多。過氧化物酶體含有豐富的酶類，主要是氧化酶、過氧化氫酶。其中的氧化酶可以催化過氧化氫的產生，過氧化氫酶是過氧化物酶體的標志酶，能夠催化過氧化氫的分解，從而使細胞免受過氧化氫的毒害。

3. pH是怎樣影響酶活性的？可以恢復嗎？

pH影響酶活性的原因可用以下兩個方面加以理解：

（1）過酸、過堿可以破壞酶的空間結構，使酶失活，這樣的破壞是不可逆轉的；

（2）當pH改變不是很劇烈時，pH造成影響可以這么分析：

①影響底物的解離狀態，使底物不能和酶結合或者結合以后不能生成產物；

②影響酶活性部位有關基團的解離，從而影響與底物的結合或催化；各種酶在維持最適pH時所處的某種解離狀態，最有利于與底物結合并發生催化，如膽堿酯酶解離成兩性離子、精氨酸酶呈負離子時活力最大；

③影響到中間產物ES的解離狀態，不利于催化產物生成。

在相對微小的范圍中，pH對酶活性造成的影響是可以恢復的，正像酸堿緩沖劑中提取或保存酶溶液是一個共識的道理一樣。

4. 對于無關變量的控制“相同、等量”且“適宜”是否需要“預實驗”？

事實上，溫度對過氧化氫酶的活性是有非常大的影響的，不同溫度條件下得到的結果是有差異的。好在過氧化氫酶在本地室溫（實驗室夏季最高28℃，冬季22℃）下都能夠很好地發揮作用，因此一般并沒有進行預實驗。但值得注意的是，如果多個無關變量影響著實驗結果的話，就需要逐一找到“適宜”，比如：酶濃度、底物濃度等等。

參考文獻：

[1]汪堃仁.細胞生物學.北京：高等教育出版社，1991.

[2]翟中和.細胞生物學.北京：高等教育出版社，2001.

作者簡介：

程宏，安徽省黃山市，歙縣長青中學。endprint