OPN與VEGF在子宮腺肌病中的表達及意義

崔艷萍+薛潔好+劉群英

【摘要】 目的：檢測骨橋蛋白（osteopontin，OPN）及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在子宮腺肌病病灶、子宮腺肌病在位內膜、正常子宮肌層及正常子宮內膜中的表達，從而探討OPN、VEGF在子宮腺肌病發生與發展中的作用及兩者的相關性。方法：采用免疫組織化學方法（S-P法）檢測50例子宮腺肌病患者子宮腺肌病病灶、在位內膜及50例子宮肌瘤患者正常子宮肌層及正常子宮內膜中的OPN與VEGF的PU值。比較兩組間OPN與VEGF表達水平差異。結果：OPN、VEGF在腺肌病在位內膜分泌期中的PU值高于增生期（P<0.05）；OPN、VEGF在腺肌病在位內膜增生期與分泌期的PU值均高于在正常內膜增生期與分泌期的PU值（P<0.05）。OPN、VEGF在子宮腺肌病中的表達經Pearson積差相關分析，無相關關系（r=0.014，P=0.920）。結論：OPN與VEGF在子宮腺肌病異位內膜及在位內膜中的過度表達，兩者可能參與了子宮腺肌病的發生與發展過程。OPN與VEGF兩者在子宮腺肌病中的表達無相關性，表明兩者在子宮腺肌病的發生與發展過程中可能各自獨立起到調控作用。

【關鍵詞】 子宮腺肌病； 骨橋蛋白； 血管內皮生長因子

【Abstract】 Objective：To detect the expression of osteopontin（OPN） and vascular endothelial growth factor（VEGF） in adenomyosis focus，eutopic endometrium of adenomyosis，normal myometrium and normal endometrium to discuss the effect of OPN and VEGF in the occurrence and development of adenomyosis and the correlation between OPN and VEGF.Method：Immunohistochemical method（S-P method） was used to detect PU value of OPN and VEGF in adenomyosis focus，eutopic endometrium of adenomyosis of 50 patients with adenomyosis，and normal myometrium and normal endometrium of 50 patients with uterine fibroid.The differences regarding OPN and VEGF expression levels between two groups were compared.Result：PU value of OPN and VEGF in the proliferative and secretory phase of eutopic endometrium of adenomyosis was higher than that in normal proliferative phase，and the difference was significant （P<0.05）.PU values of OPN and VEGF in the proliferative and secretory phase of eutopic endometrium of adenomyosis were higher than those in the normal endometrial proliferative and secretory phase，there was a significant difference between two groups（P<0.05）.The expression of OPN and VEGF in adenomyosis was analyzed by Pearsons product-moment correlation analysis.There was no correlation （r=0.014，P=0.920）.Conclusion：The overexpression of OPN and VEGF in ectopic endometrium and eutopic endometrium of adenomyosis may be involved in the occurrence and development of adenomyosis.There is no correlation between OPN and VEGF in the expression of adenomyosis，indicating that both could play an independent role in the occurrence and development of adenomyosis.

【Key words】 Adenomyosis； Osteopontin； Vascular endothelial growth factor

First-authors address：Qingyuan Maternity & Child Healthcare Hospital，Qingyuan 511500，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.02.002

子宮腺肌病（adenomyosis）是子宮內膜細胞向肌層良性浸潤的雌激素依賴性疾病。子宮腺肌病雖為一種“良性疾病”，但表現出的“侵襲、轉移、復發”卻是惡性腫瘤所表現出的生物學行為，不容輕視，其發病率年輕化并且呈上升趨勢。目前許多研究表明雖發現有多種因素導致子宮腺肌病發病，但是相關研究理論對其很難做出較為理想的解釋。因此，目前臨床上對于子宮腺肌病的真正致病機制尚且沒有統一、明確的理論說明。本研究通過免疫組織化學方法（S-P法）檢測骨橋蛋白（osteopontin，OPN）及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在子宮腺肌病的異位內膜、在位內膜及正常內膜中表達的PU值，探討OPN與VEGF的相關性，揭示OPN與VEGF在子宮腺肌病疾病發生發展過程中的作用。現報道如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料 此次研究選擇在本院住院擇期行手術治療的50例子宮腺肌病患者作為研究組，病例的納入時間為2014年1月-2016年12月，另選取同時期內在本院進行手術治療的50子宮肌瘤患者為對照組。參與本次研究的所有患者入院后均進行腹腔鏡檢查，且經病理學檢查，檢查后確診。并且，本次研究的100例患者中均無糖尿病、高血壓、腎病等慢性病史，均未接受免疫藥物及甾體類激素等治療。

1.2 方法

1.2.1 研究標本分組如下：

1.2.2 所有標本收集、石蠟切片制作及實驗方法 所有標本子宮切除后“Y”字形切開子宮前壁或后壁子宮肌層至子宮腔。研究組標本：切取腺肌病病灶（大小1 cm×1 cm×1 cm）、位內膜（大小1 cm×1 cm×0.5 cm）；對照組標本：距離肌瘤邊緣2 cm以外切取正常子宮肌層（大小1 cm×1 cm×1 cm）、子宮內膜（大小1 cm×1 cm×0.5 cm）。制成石蠟塊后對每個制作標本連續切成三片，每個標本的切片厚度為4 μm。其中，第一張標本使用HE進行染色處理，通過染色確定病理診斷，子宮內膜組織切片，通過病理組織進行增生期診斷和分泌期診斷。另外兩張均采用免疫組織化學方法進行檢測，分別對樣本組織的OPN、VEGF進行檢測。完成上述操作后，將石蠟切片放在恒溫箱內進行烤片，使組織標本與載玻片緊密貼合在一起，避免石蠟切片脫落。放入恒溫箱后，設定恒溫箱的溫度，溫度設定為70 ℃，放置0.5 h。

1.2.3 實驗試劑 本次研究使用福州邁新公司生產銷售的兔抗人OPN單克隆抗體（抗體效價1∶100）為主要試劑產品，產品編號為sd-148，本研究使用的兔抗人VEGF多克隆抗體（即用型抗體）是由福州邁新公司提供的（產品編號：RAB-0157）。DAB顯色液試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.4 技術路線 技術路線如下：

1.2.5 HE染色切片結果判斷

1.2.5.1 子宮腺肌病病灶 對HE染色切片情況和內膜中腺體的表現情況進行觀察，重點觀察兩者是否存在不同步的問題，從子宮肌層中可以看到島狀的子宮內膜腺體和子宮內膜間質分布，伴有暗紅色的出血量，但難以準確鑒別子宮內膜腺體是分泌期或增生期，見圖1。

1.2.5.2 正常子宮肌層 HE染色下，切片組織中可見平滑肌束和結締組織，組織肌層出現漿膜下層、中間層和黏膜下層，其中，中間層的厚度相對大于其他漿膜和黏膜下層，而兩個下層組織表現出縱行平滑肌束，血管斷面頗為豐富，見圖2。

1.2.5.3 子宮內膜增生期 HE染色下，兩組患者的病理組織結構并不存在顯著差異，間質組織的致密度較高，螺旋動脈呈現主彎曲增長的趨勢，且在動脈上可以看到柱狀的腺上皮細胞，內膜腺體的數量相對較多，生長形態為彎曲，見圖3。

1.2.5.4 子宮內膜分泌期 HE染色下，切片組織的腺腔內有腺細胞分泌物，腺腔呈現出膨脹的狀態，內膜的腺體呈現主不斷增大、彎曲的狀態。內膜基質細胞增大，間質組織有水腫性增大，螺旋小動脈增長，且呈現出彎曲狀態，見圖4。

1.2.6 實驗結果判定 OPN陽性表達顏色為棕黃色，形態為顆粒狀，定位在內膜細胞的細胞漿中，間質細胞膜上的表達水平相對較低，且平滑肌細胞中不存在明確陽性表達。在位內膜增生期、在位內膜分泌期、子宮腺肌病病灶以及上皮細胞膜中均有不同程度的表達水平（圖5、6、7）。VEGF陽性表達顏色為黃色，形態為顆粒狀，主要定位在內膜細胞的細胞漿中，與OPN的陽性表達相同，間質細胞膜上的表達水平相對較低。并且，在病灶、增生期、分泌期、正常增生及分泌期均有不同水平表達（圖8、9、10）。

本次研究中涉及的圖像均采用Leica QW550圖像分析系統進行分析，采用陽性單位表達免疫組化結果，用來表達反應免疫組化的陽性表達水平。具體如下：選擇進行免疫組織化學法測定的切片組織進行隨機測試，測試共包括五個視場，每個視場需要測定的細胞為20個。將切片標本自身存在的影響因素取出，根據圖像的灰度對其進行分級，共分為256個等級，所分的每一個等級代表一個陽性表達單位，陽性值與陽性反應程度呈現正比例的關系。由圖像分析系統對背景平均灰度值和待測結構的灰度值進行測定，最大值設置為256，具體計算方法如下：陽性值=

1.3 統計學處理 本次研究涉及的所有數據均納入Excel表格和SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗；變量相關性數據采用Pearson積差相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基線資料比較 觀察組50例患者，年齡35～70歲，平均（45.20±4.65）歲。對照組50例患者，年齡38～57歲，平均（46.54±5.23）歲。兩組患者一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 子宮腺肌病病灶與正常子宮肌層中OPN、VEGF的表達水平分析 在子宮腺肌病病灶和正常子宮肌層中均有OPN表達，兩者OPN表達陽性值對比，差異有統計學意義（P<0.05）。在子宮腺肌病病灶和正常子宮肌層中均有VEGF表達，兩者陽性值對比，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 腺肌病病灶與在位內膜增生期、分泌期中OPN及VEGF的表達情況 OPN在腺肌病在位內膜增生期、分泌期表達陽性值比較，差異有統計學意義（P<0.05）。腺肌病病灶中OPN與在位內膜增生期表達的PU值比較，差異有統計學意義（P<0.05），但與在位內膜分泌期比較，差異有統計學意義（P<0.05）。VEGF在腺肌病在位內膜增生期與分泌期表達的PU值比較，差異無統計學意義（P>0.05）；而腺肌病病灶中VEGF的陽性表達與在位內膜增生期、分泌期的PU值相比，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。endprint

2.4 正常內膜與在位內膜增生期、分泌期的OPN及VEGF表達水平 正常內膜增生期OPN陽性表達的PU值明顯低于腺肌病在位內膜增生期，差異有統計學意義（P<0.05），正常內膜分泌期OPN陽性表達的PU值與腺肌病在位內膜分泌期表達比較，差異有統計學意義（P<0.05）。相對于腺肌病在位內膜增生期表達，正常內膜增生期VEGF陽性表達的PU值更低，差異有統計學意義（P<0.05），VEGF在正常內膜分泌期的陽性表達與在位內膜分泌期相比，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.5 OPN與VEGF的相關性 經分析，OPN與VEGF在子宮腺肌病中的表達無明顯相關性（r=0.014，P=0.920>0.05），見圖11。

3 討論

子宮腺肌病是婦科臨床上的常見病，主要是在各種因素的作用和影響下，子宮內膜間質、子宮腺體出現侵入子宮肌層的情況，并呈現出彌漫性增長趨勢。該病的首要癥狀主要表現為月經過多、漸進性痛經、不孕不育，少數患者可能有性交痛的現象。近年來，子宮腺肌病的發病率呈現逐年遞增的發展趨勢，且以中年女性、經產婦為主要患病人群，對廣大女性的身體健康和心理健康均造成了不同程度的負面影響。在子宮腺肌病患者中，約有25%的患者可能無明顯癥狀，診斷往往是在其他原因切除子宮后做病理檢查才得到診斷，導致此疾病的確切發病率不易統計[1]。子宮腺肌病的發病原因尚不清楚，異位子宮內膜來源至今尚未闡明，有學者認為機械性損傷是造成子宮肌層薄弱及子宮內膜-子宮肌層連接帶出現病理改變導致子宮內膜基底內陷內膜細胞向肌層浸潤生長的原因之一；其二有可能是女性卵巢功能失調導致發病，女性的卵巢功能失調，體內的雌激素含量過多，可能會對子宮內膜向子宮肌壁的生長起到刺激性影響，在位內膜細胞則會表現出更強的粘附性、浸潤性、侵襲性，同時刺激血管形成；免疫學說則認為，免疫細胞數量功能異常，引起分泌細胞因子發生變化，免疫功能失衡或免疫調節異常是導致異位在子宮肌層內的異位內膜細胞繼續存活和異位種植的關鍵環節[2-3]。

OPN是一種分泌型磷酸化糖蛋白的組織細胞因子，參與細胞遷移粘附，介導細胞免疫應答，抑制細胞凋亡、促進細胞增殖、活躍新生血管形成而發揮其重要生物學功能[4]。VEGF是一種特異性最高的絡氨酸激酶受體蛋白的多肽類細胞因子，借助細胞間的介導傳遞功能，加速內皮細胞的繁殖和生長速度，對血管內皮細胞的增殖功能起到了刺激性作用，可誘導新生血管形成而發揮重要生物學功能[5]。

在此次研究中，子宮腺肌病病灶中的OPN、VEGF表達水平均高于正常子宮肌層，而腺肌病在位內膜增生期中的OPN、VEGF PU值分別為（19.29±8.05）和（29.79±4.58），而在正常內膜增生期中PU值分別為（11.41±4.36）和（16.58±6.47）；同樣OPN、VEGF在腺肌病在位內膜分泌期中的PU值[（25.82±6.48）和（27.86±4.31）]明顯高于正常內膜分泌期中PU值[（13.06±3.28）和（13.76±3.09）]，兩者比較差異均有統計學意義（P<0.05）。在位內膜中OPN的表達上調促使子宮內膜細胞侵入子宮肌層；機體自身存在一定的應激機制，VEGF的介導或分泌是通過局部組織合成適當缺氧誘導因子而進行的，局部組織中會形成大量的新生血管，這些新生血管會重新排布，保障侵入肌層的子宮內膜細胞具備充足營養，這也就導致子宮內膜上更容易出現種植、遷移和增值的現象，侵襲性更強，從某種程度上對子宮腺肌病的進展起到了促進作用[6-8]。此外，本次研究中還對宮腺肌病在位內膜增生期與分泌期中的OPN表達情況進行了系統化研究，從研究結果中可以看出，增殖期的OPN陽性表達的PU值要低于分泌期。這說明OPN陽性表達在分泌期若出現上調，則會對相關細胞因子產生激活性作用，可能導致孕激素分泌量過多[9-12]。子宮內膜增殖期向分泌期轉變，在此過程中，子宮內膜細胞的特性會受到孕激素等因素的影響，受到影響后自然發生變化，遷移性和增值性也會明顯增強，這就導致分泌期內膜細胞進入子宮肌層的可能性更大，患者的患病率也就更高[13-15]。此外，在腺肌病在位內膜增生期與分泌期的VEGF表達對比上，增值期的PU值為（29.79±4.58），而分泌期的PU值為（27.86±4.31），雖然兩個時期的PU值存在一些差異，但差異無統計學意義（P>0.05）。通過對腺肌病病灶中VEGF的陽性表達與在位內膜增生期和分泌期中VEGF陽性表達的PU值進行分別對比，差異有統計學意義（P<0.05）。從該結果中可以看出，增生期或分泌期，在位內膜組織中VEGF均高于正常組織，出現此種結果的原因可能是在位內膜中VEGF的表達上調，而子宮腺肌病是在內膜間質中，有新生血管，且原有血管進行重新分布，這就導致子宮內膜細胞的遷移速度不斷加快，為肌層浸潤提供更多的可能性[16-20]。

在本組研究中，對OPN、VEGF與子宮腺肌病的相關性進行了研究，但兩者在疾病的發生和進展過程中是否存在協同作用，或者兩者是獨立發揮作用的，本研究中并未提及。本組研究結果顯示，雖然兩者的生物學功能相似性較高，但兩者之間并不存在明顯的相關性，說明兩者在疾病的進展過程中極有可能是獨立存在并發揮作用的，這與文獻[9-10]報道的研究結果存在異議，出現此種現象的原因可能是本次研究與以往報道中的原發病類型不同。因此，OPN與VEGF的相互作用及具體的機制仍需繼續研究。

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（收稿日期：2017-08-03） （本文編輯：程旭然）endprint