中藥活性成分誘導肝細胞癌自噬的體外實驗研究進展

林彤 沙永強 陳澤雄

[摘要] 自噬是細胞高度保守的自我更新機制，是機體諸多生理病理過程的核心環節。自噬是腫瘤調控的雙刃劍，它抑制早期腫瘤發展，也促進晚期腫瘤生長。肝細胞癌（HCC）復發率高、預后差，目前尚缺少有效的治療方法。縱觀文獻，多種抗癌中藥活性成分可提高HCC細胞的自噬水平，或引發自噬性死亡，抑制腫瘤；或引發保護性自噬，支持腫瘤生存、削弱抗癌藥物療效。本文對中藥活性成分誘導HCC自噬方面的研究成果作一綜述，為以自噬為靶標的抗HCC藥物研發提供新思路。

[關鍵詞] 自噬；肝細胞癌；中藥；活性成分；研究進展

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（a）-0049-05

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發性肝癌的90%，是世界上第五常見的癌癥，是癌癥死亡的第三個原因[1]。雖手術切除、肝移植等對早期患者有效，但大多數患者確診時已錯失手術時機，晚期HCC患者中位生存率在1年以下[2]。中藥來源豐富，價格低廉，毒副作用小，極具新一代抗癌藥物開發潛力，多種中藥抗癌活性成分對各類腫瘤表現出一定的自噬調節作用，本文主要對誘導HCC自噬的中藥成分展開論述。

1 自噬

自噬（autophagy）是真核細胞依賴溶酶體降解自身胞質組分的過程，受損細胞器或錯誤折疊的蛋白質被消化成大分子物質并釋放能量供細胞循環利用[3]。細胞自噬一般保持在較低的基礎水平，對細胞生長發育、結構重塑、物質更新、穩態維持和代謝平衡有至關重要的作用。當遇到生存壓力（饑餓、缺氧等）或損傷應激（氧化應激、基因突變等），自噬水平急劇升高，作為細胞的保護機制，但過度的自噬會導致自噬性死亡（Ⅱ型程序性細胞死亡）[4]，這種細胞死亡因不依賴caspase家族而有別于凋亡。自噬缺陷廣泛存在于癌癥、代謝障礙、神經退行性病、肌病及衰老的病理過程中[5]。

自噬涉及起始、成核、延伸、自噬溶酶體形成和降解5個步驟，由一系列自噬相關基因（autophagy associated gene，ATG）編碼的蛋白質調控。自噬有3種類型：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侶介導的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）。巨自噬指雙層膜囊泡包裹底物形成“自噬體”，自噬體與溶酶體融合成自噬溶酶體，溶酶體進而分解底物；微自噬指溶酶體表面內陷形成單層膜囊泡，直接包裹底物；CMA指胞漿中的底物同分子伴侶結合后被轉運至溶酶體內[4]。本文中的自噬均指巨自噬。

2 自噬與腫瘤的關系

自噬對腫瘤的調控是動態而矛盾的，目前多數學者認為自噬抑制早期腫瘤發展，促進晚期腫瘤生長。自噬防止正常細胞損傷和癌變：①細胞內活性氧簇（ROS）能導致基因突變，其來源是受損的細胞器，自噬清除異常細胞器，避免氧化損傷，保持基因組穩定，防止腫瘤萌生。②炎癥環境有助于惡性細胞增殖，并刺激腫瘤血管生成，自噬減輕炎癥和壞死，塑造不利于腫瘤生長的微環境。③自噬通量過大時引發腫瘤細胞的自噬性死亡[6]。

自噬保護正常細胞，同理也保護腫瘤細胞：①自噬為代謝需求提高的晚期腫瘤細胞提供營養，促進細胞存活。②內皮細胞的自噬有助缺氧環境中腫瘤血管的生成，加速腫瘤生長和轉移[7]。③自噬可削弱免疫細胞對腫瘤的殺傷力，導致腫瘤免疫逃逸[8]。④某些癌基因（如RAS）驅動的腫瘤存在一定自噬依賴性。自噬對腫瘤的作用取決于腫瘤類型、階段、遺傳性質和自噬水平等多方面因素[9]。

自噬對HCC的調控也呈兩面性：可抑制HCC，如自噬相關蛋白Beclin-1的表達水平與HCC等級成負相關[10]；ATG5缺陷的小鼠僅產生肝臟腫瘤[11]；也可促進HCC，如在晚期肝癌中檢測到自噬增加，且與患者的低存活率密切相關[12]。由此觀之，自噬在HCC中有特殊的地位，可能與肝臟代謝較快，對自噬有一定依賴有關。因此，選擇自噬作為HCC的治療靶點有廣闊前景，研究中醫藥對HCC細胞自噬的調控有實在意義。

3 中藥活性成分誘導HCC細胞自噬

中醫藥治療腫瘤歷史悠久，主要機制即誘導細胞死亡，包括細胞凋亡、細胞自噬、細胞壞死等[13]。近年諸多研究報道了多種抗癌中藥成分具有自噬調控作用，相對于自噬對腫瘤的雙面調控，這些中藥活性成分的作用也可分為殺傷和保護兩類。

3.1 自噬發揮殺傷作用

木犀草素（luteolin）是一種天然類黃酮化合物，存在于金銀花、菊花等中藥中，具有抗菌、調節免疫、抗氧化等效用[14]。木犀草素以濃度依賴方式誘導HCC細胞株HepG2內ROS的增加，并誘導自噬[15]。Cao等[16]發現木犀草素抗HCC細胞株SMMC-7721增殖，提高胞內自噬體數量，自噬蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化，Beclin-1表達增加，自噬抑制劑氯喹干預后凋亡減少，表明木犀草素誘導的自噬促進凋亡。

紫草多糖是紫草的一種水溶性提取物，具有抗炎、解熱鎮痛、抗腫瘤等作用。陳奇等[17]的研究顯示紫草多糖顯著降低H22肝癌荷瘤小鼠的瘤質量系數，抑瘤率達34.7%，且顯著上調瘤組織中自噬相關基因ATG5、Beclin-1和LC3的表達，提示紫草多糖可能通過促進自噬抑制瘤體生長。

龍葵具有抗癌、抗氧化、抗炎、保肝等作用[18]。單獨使用龍葵水提取物對HepG2及Hep5J細胞即有抗增殖活性，同順鉑或阿霉素聯用能增強兩種化療藥的毒性，同時觀察到LC3-Ⅱ的聚集，說明龍葵引導的化療增敏可能與其誘導自噬相關[19]。

苦參堿（murine）是苦參的主要活性成分，具有抗病毒、抗過敏和抗腫瘤等作用[20]。Yang等[21]發現，苦參堿抑制活體內肝癌MHCC97L移植瘤生長，促進MHCC97L和Huh-7細胞中LC3-Ⅱ、Beclin-1和PI3KC3的上調及自噬底物p62的下調，提示苦參堿通過驅動自噬限制瘤體增長。

小檗堿（berberine）是存在于黃連和黃柏中的一種異喹啉生物堿，能抗炎、抗癌、降血糖[22-24]。Yu等[25]發現小檗堿通過活化AMPK誘導HepG2細胞自噬性死亡，敲除自噬相關基因或干擾AMPK后，細胞死亡率顯著下降，而使用AMPK激活劑后細胞死亡率上升。

丹酚酸B（salvianolic acid B）是丹參的主要水溶活性成分，它誘導SK-Hep-1及Bel-7404細胞的凋亡和AKT/mTOR通道依賴性自噬。電鏡下觀察到廣泛的自噬體結構，免疫熒光觀察到LC3點的數量增多。阻斷自噬后細胞凋亡率降低，說明丹酚酸B誘導的自噬加強凋亡[26]。

麥冬皂苷B抑制HepG2細胞增殖，流式細胞術顯示其并不影響細胞周期和凋亡，吖啶橙染色及GFP-LC3質粒轉染實驗均提示自噬囊泡增加，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化、Beclin-1表達提高，自噬抑制劑3-MA幾乎完全逆轉自噬及細胞毒作用，提示麥冬皂苷主要通過誘導自噬性死亡抗癌[27]。

小白菊內酯是艾菊的主要活性成分，有抗炎、抗癌、抗動脈粥樣硬化等作用[28]。劉戰培等[29]發現小白菊內酯抑制SMMC-7721細胞增殖，吖啶橙染色見自噬泡陽性細胞數增加，LC3表達增加，p62底物減少，用NH4CL抑制自噬底物降解后細胞中LC3表達增加，說明小白菊內酯加強了自噬流。阻滯ROS使自噬流顯著下降，說明ROS參與了小白菊內酯導致的自噬性死亡。

川芎嗪（ligustrazine）除了應用于心腦血管外也被發現有抗癌作用。Cao等[30]發現川芎嗪引起HepG2細胞自噬，在體、內外實驗中均抑制腫瘤生長。進一步研究發現自噬由ROS介導產生，抑制自噬或ROS均減弱其抗癌效果，證明川芎嗪誘導的自噬呈殺傷性。

3.2 自噬發揮保護作用

蟾毒靈（bufalin）是從蟾酥中提取的成分，具有抗癌、強心和增強免疫等藥理作用。研究發現在Huh-7和HepG2細胞中，蟾毒靈激活JNK通路，誘導內質網應激，進而激活自噬，阻斷自噬后凋亡增強，說明蟾毒靈誘導保護性自噬，與其誘導的凋亡相拮抗[31]。

黃芩素（baicalin）是從黃芩中分離出的植物雌激素樣物質，Wang等[32]發現黃芩素以劑量和時間依賴方式誘導SMMC-7721和BEL-7402細胞自噬，敲除ATG5和Beclin-1兩個自噬基因后，細胞凋亡率升高，說明黃芩素發揮保護作用。

甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）憑借高度的肝細胞親和力，廣泛應用于肝細胞靶向給藥系統，它能降低肝癌細胞的活力，誘導凋亡和自噬[33]。GA激活ERK通路誘導自噬，使用藥理方法或阻斷ERK通路抑制自噬后，細胞活力進一步下降，凋亡蛋白增加，說明這種自噬是保護性的，會削弱GA或其所修飾納米粒子所載化療藥之療效[34]。

褐藻素（fucoxanthin）為昆布的有效成分之一，廖政邦等[35]的實驗發現，褐藻素誘導HepG2細胞自噬和凋亡，表現為Beclin-1、LC3蛋白增加及自噬溶酶體的形成，Akt的活化受抑制。3-MA干預提高凋亡率并促進caspase-3活化，提示褐藻素可能通過抑制Akt通路誘導保護性自噬。

姜黃素（curcumin）是從姜黃、郁金、莪術等中藥中提取的一種酸性酚類物質，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用。姜黃素誘導SMMC-7721細胞凋亡的同時還通過抑制Akt/mTOR誘導自噬，抑制自噬能增強其細胞毒力。這提示我們，誘導保護性自噬的藥物需與自噬抑制劑同用才能發揮更好的療效[36]。

桔梗皂苷-D（platycodin-D）是桔梗總皂苷的主要成分，有鎮痛、抗炎、免疫調節等作用。桔梗皂苷-D誘導BEL-7402和HepG2細胞凋亡和自噬，可見胞質空泡形成、LC3-Ⅱ表達增加和MDC染色陽性細胞數增加。阻斷自噬或ERK和JNK途徑后，凋亡明顯增強，小鼠異位移植瘤體積縮小，說明桔梗皂苷-D誘導保護性自噬，且與ERK和JNK途徑的激活相關[37-38]。

β-欖香烯（β-elemene）存在于郁金和莪術中，它抑制HepG2細胞增殖并誘導自噬，并可使HepG2免受無血清饑餓誘導的凋亡。在小鼠H22實體瘤模型中，β-欖香烯以劑量依賴性降低阿帕替尼的效力，阻斷自噬后細胞凋亡明顯升高，說明其誘導的自噬抵消了部分細胞凋亡，使療效大打折扣[39]。

葫蘆素B（cucurbitacin B）是瓜蒂的提取物，有廣泛的抗癌作用。Niu等[40]發現，葫蘆素B能抑制BEL-7402細胞增殖，通過ROS介導細胞DNA損傷、凋亡和自噬，MDC染色、LC3-Ⅱ的上調、ULK1和AKT/mTOR的磷酸化證實了自噬的發生。下調PTEN阻斷自噬后凋亡增強，提示PTEN參與了葫蘆素B誘導的保護性自噬。

4 總結與展望

自噬影響腫瘤的形成、增殖、治療反應與轉移等方面，是腫瘤發病的核心機制之一，它扮演著復雜的角色。在健康細胞中，自噬清除ROS和炎癥防止惡變，這是其質控功能的體現；在腫瘤細胞中，自噬通過營養循環支持腫瘤生長，這是其作為生存機制的體現。自噬或直接起作用，或與凋亡、壞死、炎癥等其他細胞通路聯系，共同決定腫瘤的命運。中藥對腫瘤自噬的調控紛繁復雜，即使同一中藥單體對不同腫瘤類型可有相反的自噬效應。中藥調控自噬的研究仍處于初級階段，明確特定條件下自噬的分子機制是自噬靶向藥研發的理論基礎。

誘導腫瘤細胞自噬性死亡是一條可行的抗腫瘤途徑，需注意的是，正常細胞有一個平穩的自噬水平，靶向自噬的治療中，對具體信號分子的選擇是關鍵，要減少對正常細胞自噬的影響。另外，誘導凋亡是許多抗癌藥物的共同機制，自噬與凋亡間有豐富的交叉網，一些藥物誘導的保護性自噬會削弱凋亡，抑制這些自噬可減輕治療抵抗。相比中藥單體，中藥復方有更全面的療效也更貼近臨床，但目前對復方的研究尚少，可通過血清藥理學方法開展更多復方研究。中醫藥經自噬調節治療腫瘤有廣闊應用前景，充分研究后投入臨床定能造福廣大患者。

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（收稿日期：2018-03-26 本文編輯：封 華）