六棱菊的薄層鑒別和橙皮苷含量測定研究

魏江存 陳勇 謝臻 秦祖杰 黃冬美 馬家寶

摘要：以橙皮苷為指標性成分，建立六棱菊（Laggera alata）薄層鑒別和含量測定方法，比較廣西不同產地的六棱菊中橙皮苷含量。薄層色譜中可以檢出橙皮苷，斑點清晰，專屬性好。橙皮苷進樣量在0.30～2.25 μg范圍（R2=0.999 6）呈良好的線性關系。六棱菊低、中、高加樣組橙皮苷的平均回收率分別為99.60%（RSD=2.78%）、99.97%（RSD=2.08%）和99.01%（RSD=1.36%）。廣西境內10批不同產地的六棱菊中橙皮苷的含量差別較大，這可能與氣候、溫度、土壤、水分、光照等生長條件有關。該方法能有效鑒別六棱菊，準確測定橙皮苷含量，為開發利用六棱菊資源提供了科學依據。

關鍵詞：六棱菊（Laggera alata）;橙皮苷;薄層色譜法;高效液相色譜

中圖分類號：S567.23+9? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）23-0139-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.033? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

六棱菊（Laggera alata）系菊科六棱菊屬植物，全草入藥，性苦、辛，微溫，有祛風、除濕、解毒之功效，主要分布于中國東部、東南部至西南部，北至安徽和湖北[1，2]，因其新鮮的枝葉揉搓后散發特殊的臭味，在民間作為抗菌消炎、清熱解毒的良藥，云南民間稱之為“臭靈丹”[3]，以臭靈丹為主的許多復方制劑在臨床上應用也取得較好的療效[4-8]。六棱菊常用于跌打損傷、燒燙傷、毒蛇咬傷、感冒咳嗽、風濕關節炎、皮膚濕疹和腹痛瀉痢等多種疾病[3]。目前，臨床多用于呼吸道疾病[9]、感冒[10]和病毒感染[11]等疾病的治療，但其有效成分尚不明確。近年來，國內外學者對六棱菊進行了相關研究，試驗表明[3，12-17]，六棱菊主要含黃酮類、倍半萜類和酚酸類等化合物。目前，國內外未見對其進行薄層鑒別和含量測定的相關研究，為保證其藥材質量及臨床療效，本試驗建立了六棱菊橙皮苷的薄層鑒別和含量測定方法，為建立六棱菊活性成分科學、合理、可控的質量標準提供科學依據。

橙皮苷是極有藥用價值的天然資源，研究表明[18，19]，橙皮苷在抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗心肌缺血、血脂調控、抗血栓、降血壓及抗心律失常等心血管保護作用方面均有較好的效果，中國擁有豐富的橙皮苷資源，測定六棱菊中橙皮苷的含量，并比較廣西不同產地六棱菊中橙皮苷的含量差異，以完善六棱菊的質量控制。

本研究將同時對廣西境內10批不同產地的六棱菊進行橙皮苷的薄層鑒別和對其含量測定，為六棱菊藥材的質量評價提供參考，也為研究六棱菊藥材的質量控制新方法奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 儀器

2695型高效液相色譜儀（包括2489UV，四元泵、真空脫氣泵、自動進樣器、柱溫箱和Empower3液相工作站），美國Waters公司;Simplicity超純水系統，密理博中國有限公司;Practum224-1CN分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司;SHB-III循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司;DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司;TGL-16G高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠;HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司;尼龍66（Nylon）-22 μm微孔濾膜，天津津騰。

1.2? 試藥

橙皮苷對照品（批號：170213，純度>98.0%，上海融禾醫藥科技有限公司）;甲醇為色譜純（Fisher， 4 L）;乙醇、磷酸、醋酸和其他試劑為分析純，試驗用水為去離子水。六棱菊藥材采摘于廣西賀州市昭平縣，經廣西中醫藥大學中藥鑒定教研室老師鑒定為菊科六棱菊屬植物六棱菊的全草。薄層硅膠G板，青島海洋化工廠。試驗所有樣品（表1）執行標準均為2015年版《中國藥典》一部。

1.3? 方法

1.3.1? 六棱菊樣品制備? ?采集六棱菊全草，自然曬干后，將其粉碎過三號篩，備用。

1.3.2? 薄層鑒別? 稱取六棱菊藥材粉末5 g，加75%乙醇100 mL，回流1 h，濾過，濾液揮干加甲醇3 mL使其溶解，作為六棱菊供試品溶液。取橙皮苷對照品適量，加甲醇溶解，配制成0.32 mg/mL的對照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水體積比為100∶18∶12為展開劑，展開5 cm，取出，晾干，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1）的上層溶液作為展開劑，展開12 cm，取出晾干，噴1%的三氯化鋁試液，置325 nm紫外光燈下檢視。

1.3.3? 陰性對照溶液的制備? 量取75%乙醇100 mL，回流1 h，濾過，濾液揮干加甲醇3 mL使其溶解，將其作為陰性對照溶液。

1.3.4? 對照品溶液制備? 精密稱取橙皮苷3.75 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得橙皮苷對照品儲備液，濃度為0.15 mg/mL。

1.3.5? 供試品溶液制備? 精密稱取六棱菊藥材粉末1.0 g，75%乙醇提取，回流，以半徑0.65 cm，13 000 r/min離心10 min，取上清液0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.3.6? 標準曲線的制備? 精密吸取橙皮苷對照品溶液（濃度為150 μg/mL）2、5、8、10、12、15 μL注入液相色譜儀，以峰面積和進樣量（μg）分別為縱坐標和橫坐標，繪制標準曲線并計算回歸方程。

2? 結果與分析

2.1? 薄層鑒別

薄層鑒別結果檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置處，顯相同顏色的斑點，陰性對照色譜在相應位置處無干擾（圖1）。

2.2? 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.60 mm× 250 mm，5 μm），流動相：甲醇-0.5%醋酸（36∶64），檢測波長283 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，按照上述條件各組分分離度良好（圖2）。

2.3? 標準曲線

在“1.3.6”條件下繪制標準曲線為Y=2.0×106X-15 721（R2=0.999 6）。表明橙皮苷進樣量在0.30～2.25 μg呈良好的線性關系。

2.4? 精密度試驗

精密量取對照品溶液適量（150 μg/mL），按“2.2”項的條件連續進樣6次，計算橙皮苷峰面積的 RSD為0.23%，小于3%，說明儀器精密度良好。

2.5? 穩定性試驗

取同一批六棱菊藥材粉末1.0 g，按“1.3.5”項下的方法制備供試品溶液，在0、2、4、8、12、24 h后按“2.2”項的條件測定，計算六棱菊峰面積的RSD為2.948%，小于3%，說明24 h內供試品溶液穩定性良好。

2.6? 重復性試驗

精密稱取同一批六棱菊藥材粉末1.0 g，精密稱定，共6份，按“1.3.5”項下的方法制備成供試品溶液，按“2.2”項的條件測定，計算六棱菊橙皮苷平均含量為0.782 3 mg/g，其RSD為2.86%，小于3%，表明該方法重復性良好。

2.7? 加樣回收率試驗

精密稱取同一批已知含量的六棱菊藥材粉末（含量為0.782 3 mg/g），共9份，分成3組，即低、中、高加樣組（0.5 g藥材含量的80%、100%和120%加樣，加樣量分別為0.312 0、0.391 5、0.469 5 mg），六棱菊低、中、高加樣組的橙皮苷的平均回收率分別為99.60%、99.97%、99.01%，RSD分別為2.78%、2.08%、1.36%（n=3），表明該方法準確性良好（表2）。

2.8? 樣品含量測定

精密稱取六棱菊藥材粉末（過3號篩）1.0 g，按“1.3.5”項下的方法制備成供試品溶液，采用外標一點法計算橙皮苷的含量，結果見表3。

3? 小結與討論

3.1? 流動相的考察

考察了不同甲醇-酸水系統和乙腈-酸水系統（0.05%磷酸、0.1%磷酸、0.2%磷酸、0.5%冰醋酸、0.2%冰醋酸和去離子水），結果表明，甲醇-0.5%冰醋酸溶液作為流動相時，分離度相對較好，基線較平穩，出峰時間適當，故流動相確定為甲醇-0.5%冰醋酸水溶液。

3.2? 波長的考察

采用二極管陣列檢測器，在200～400 nm波長下對樣品和對照品溶液進行全波長掃描，橙皮苷在283和325 nm下有最大吸收。在283和325 nm檢測波長時，325 nm基線漂移以及雜峰較多，而用 283 nm時，基線相對平穩，雜峰較少，溶劑峰小，橙皮苷響應值較大，故最終采用283 nm作為本試驗的檢測波長。

3.3? 小結

廣西不同產地的六棱菊藥材均含有橙皮苷，且橙皮苷含量差異較大，百色田東縣所產的六棱菊藥材所含橙皮苷含量最高，其次是廣西富川縣和廣西賓陽縣，而廣西百色靖西市和南寧上林縣橙皮苷含量最低。

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