綿茵陳藥材中綠原酸提取工藝優(yōu)化*

伍 彬，江尚飛，邱妍川，楊宗發(fā)

（重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 401331）

綿茵陳為菊科多年生草本植物濱蒿 Artemisia scoparia Waldst．et Kit．或茵陳蒿 Artemisia capillaris Thunb．的干燥地上部分，春季幼苗高6～10 cm時(shí)采收，或秋季花蕾長成至花初開時(shí)采割，除去雜質(zhì)和老莖，曬干。春季采收的習(xí)稱為“綿茵陳”，秋季采收的稱為“花茵陳”，習(xí)稱“茵陳蒿”。其藥用歷史悠久，味苦、辛，性微寒，歸脾、胃、肝、膽經(jīng)，主治濕熱黃疸、膽囊炎、小便不利、風(fēng)癢瘡疥、濕瘡瘙癢、濕溫初起。目前，從金銀花和杜仲中提取綠原酸的工藝研究較廣泛，技術(shù)較成熟，但隨著金銀花和杜仲市場價(jià)格的攀升，生產(chǎn)成本日趨上升，因此，綠原酸的提取需要新思路[1－5]。本研究中通過正交試驗(yàn)考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、固液比、提取次數(shù)等因素對綿茵陳綠原酸提取率的影響[6－8]，并優(yōu)選出綿茵陳中綠原酸的最佳提取工藝。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

SB－120DT型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；JCE－3K型高精度計(jì)數(shù)桌秤（臺(tái)灣鈺恒股份有限公司）；PC4010型高效液相色譜儀（美國蘭博公司)，包括二元高壓泵、Mode 201紫外檢測器、Kromasil C18色譜柱；AUX220型雙量程分析天平（日本島津公司）；SE－80型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ZN－100型高速中藥粉碎機(jī)（長沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠）。

1．2 試藥

綿茵陳藥材（500 g，原產(chǎn)地重慶，重慶慧遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，批號(hào)150401）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)151558－201207）；無水乙醇及其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 綠原酸含量測定

2．1．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：YMC－Pack Pro C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 － 水（10 ∶90）；檢測波長：345 nm；流速：1．0 mL ／min；柱溫：30 ℃ ；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)均不低于5 000，綠原酸與相鄰峰分離度均大于1．5。色譜圖見圖1。

2．1．2 溶液制備

對照品溶液：稱取綠原酸對照品21．50 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液，精密量取5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（含綠原酸 43 μg ／mL）。

圖1 綿茵陳高效液相色譜圖

供試品溶液：取綿茵陳藥材，40℃恒溫干燥1．5 h后，粉碎，過40目篩，精確稱取5 g，用溶劑浸提，過濾，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，定容至100 mL容量瓶中。精密吸取10 mL，揮干溶劑，殘?jiān)眉状挤执稳芙猓D(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2．1．3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定綠原酸峰面積。結(jié)果的RSD為0．30%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

線性關(guān)系考察：分別精密量取綠原酸對照品貯備液0．5，1．0，2．0，5．0，10．0，15．0，20．0 mL，分別置 50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。分別取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定其峰面積，并以峰面積值（Y）對進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝13．955 X＋7．944 8，r＝0．999 3(n＝7)。結(jié)果表明，綠原酸質(zhì)量濃度在 2．15 ～86．00 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一對照品溶液和供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)連續(xù)進(jìn)樣 3 次，各 10 μL，測定綠原酸峰面積。結(jié)果的 RSD分別為 0．40%和0．80%(n＝7)，表明溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：按擬訂含量測定方法，取同一批號(hào)藥材，同時(shí)制備6份供試品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，計(jì)算綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果的 RSD為1．30%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的供試品6份，分別精密加入一定量的綠原酸對照品，照供試品溶液制備方法制備溶液，精密吸取 10 μL，注入色譜儀中，測定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2．2 提取工藝單因素考察

提取溶劑：準(zhǔn)確稱取3份樣品，分別以純水、40%乙醇、70%乙醇為提取溶劑，固液比（粗粉∶溶劑）為 1∶30（g／mL），浸漬24 h，用2．1．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)樣，測定綠原酸收率，考察不同溶劑與收率的關(guān)系。結(jié)果見圖2。可見，乙醇提取時(shí)收率明顯升高，故初步確定提取溶劑為乙醇。

表1 綠原酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

圖2 提取溶劑對綠原酸收率的影響

提取方法：準(zhǔn)確稱取3份樣品，選擇70%乙醇為提取溶劑，固液比（粗粉 ∶溶劑）為 1 ∶30（g／mL），提取 2 次，用2．1．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)樣，比較超聲法（110 kHz，30 ℃ ，每次 30 min），滲漉法（浸泡 24 h，流速為 2 mL ／min，直至無色），回流法（1．5 h ／次）的提取效果，考察不同提取方法與收率的關(guān)系。結(jié)果見圖3。可見，從左到右收率依次為 0．186，1．608，1．234 mg ／g，超聲提取收率最大，綿茵陳以超聲提取為佳。

圖3 提取方法對綠原酸收率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)：準(zhǔn)確稱取5份樣品，在溫度為30℃、提取時(shí)間為30 min、提取次數(shù)為2次、固液比（粗粉∶溶劑）為 1 ∶30（g／mL）的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)與收率的關(guān)系。結(jié)果見圖4。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，綠原酸收率上升，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)升高乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取率反而下降，故確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸收率的影響

提取溫度：準(zhǔn)確稱取5份樣品，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、提取時(shí)間為30 min、提取次數(shù)為2次、固液比（粗粉 ∶溶劑）為 1 ∶30（g／mL）的條件下，考察提取溫度對收率的影響。結(jié)果見圖5。綠原酸的收率起初隨溫度的升高而增加，35℃時(shí)收率達(dá)到最高，為 5．280 mg／g，以后收率逐漸下降。可能是由于溫度的升高加速了綠原酸的分解，因此乙醇提取綠原酸溫度以35℃為最佳。

圖5 提取溫度對綠原酸收率的影響

提取時(shí)間：準(zhǔn)確稱取5份樣品，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60% 、溫度為 35 ℃、固液比為 1 ∶30（g／mL）、提取次數(shù)為2次的條件下，考察超聲時(shí)間對收率的影響。結(jié)果見圖6。隨著超聲時(shí)間的延長，綠原酸收率呈正增長趨勢，時(shí)間越長收率越高，但趨勢越來越緩，因此提取時(shí)間以30 min為宜。

圖6 提取時(shí)間對綠原酸收率的影響

提取固液比：準(zhǔn)確稱取5份樣品，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、溫度為35℃、提取時(shí)間為30 min、提取次數(shù)為2次的條件下，考察固液比對收率的影響。結(jié)果見圖7。隨著固液比的增加，綠原酸的收率明顯增加。因?yàn)樵黾犹崛∪軇┯昧磕茉黾庸桃航佑|面積，提高溶質(zhì)擴(kuò)散速率，從而提高提取率。當(dāng)固液比提高到1∶30以后，收率增加幅度降低。綜合考慮收率和乙醇回收，故固液比選用1∶30較合理。

圖7 提取固液比對綠原酸收率的影響

提取次數(shù)：準(zhǔn)確稱取3份樣品，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、溫度為 35 ℃、提取時(shí)間為 30 min、固液比為 1 ∶30（g／mL）的條件下，考察提取次數(shù)對收率的影響。結(jié)果見圖8。提取次數(shù)越多，提取率越高，但單次提取效率越低，且雜質(zhì)也相對增加，因此提取2次效果較好。

圖8 提取次數(shù)對綠原酸收率的影響

2．3 提取工藝正交試驗(yàn)優(yōu)選

考慮到4種因素的相互作用及提取液濃縮、雜質(zhì)含量的問題，試驗(yàn)選擇乙醇作為提取溶劑，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素 A）、提取時(shí)間（因素 B）、提取溫度（因素 C）、固液比（因素D）進(jìn)行4因素3水平的 L9（34）正交試驗(yàn)。結(jié)果見表2至表4。因素A和因素C對結(jié)果影響顯著；因素B和因素D對提取影響不顯著。結(jié)合單因素試驗(yàn)，綜合考慮提取液濃縮等因素，確定超聲輔助提取綿茵陳粗粉綠原酸的最佳工藝參數(shù)為A2B2C3D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間 30 min，提取溫度 35 ℃ ，固液比 1 ∶20（g／mL），提取2次，綿茵陳綠原酸收率為109．9 mg(每20 g藥材)，即試驗(yàn)5中條件為最佳試驗(yàn)條件。

表2 提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

表3 提取工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果(n＝9)

表4 方差分析結(jié)果

3 討論

采用高效液相色譜法測定綠原酸含量已多見報(bào)道，但文獻(xiàn)中色譜條件的流動(dòng)相中加入了緩沖鹽，其流動(dòng)相組成為 0．2 mol／L 磷酸二氫鈉緩沖液 － 甲醇（75 ∶25），調(diào)pH至3．0，由于緩沖鹽對液相系統(tǒng)及色譜柱損傷較大，故本研究中未采用。另見文獻(xiàn)報(bào)道，流動(dòng)相組成為[甲醇 －3%醋酸水溶液（15∶85）]，其中醋酸比例較高，且峰形拖尾。因此，本研究中從色譜柱的篩選著手，首先嘗試使用較常用的 Zorbax SB－C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm，美國安捷倫公司）為色譜柱，以乙腈 － 水（10 ∶90）為流動(dòng)相，檢測波長為 345 nm，流速為 1．0 mL／min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL，但主峰拖尾，可能原因?yàn)樵摽钌V柱填料并未封端，殘存的硅醇基與待測物發(fā)生氫鍵作用造成拖尾。經(jīng)過篩選，色譜柱選用了日本YMC －Pack Pro C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），該色譜柱在傳統(tǒng)ODS柱基礎(chǔ)上采用更高純度硅膠基質(zhì)及更先進(jìn)端基封尾技術(shù)，與傳統(tǒng)ODS柱相比，具有更好的耐久性及批次重復(fù)性，對綠原酸具有更好的分離效果，且主峰峰形良好。因此，本研究中最終采用文中的色譜條件，其組成簡單，重復(fù)性好，適于分析茵陳中的綠原酸[9－13]。

本研究中選擇超聲法、滲漉法、回流法3種常見中藥提取方法對有效成分進(jìn)行提取，比較了不同溶劑、不同提取溫度與提取時(shí)間、不同提取固液比等對綠原酸收率的影響。在考察單次提取時(shí)間與提取次數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，提取30 min與更長時(shí)間，提取2次與3次的綠原酸收率幾乎相同，考慮到提取時(shí)間越長、次數(shù)越多，雜質(zhì)含量越高，最終確定以較短時(shí)間、較少次數(shù)進(jìn)行綠原酸的提取；在乙醇體積分?jǐn)?shù)考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，綠原酸收率也隨之升高，但乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%時(shí)，收率反而下降，可能與由于高體積分?jǐn)?shù)乙醇使得一些大分子物質(zhì)和綠原酸產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，造成綠原酸的損失有關(guān)[14－15]。

結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果，從便于控制、成本低、周期短三方面考慮，最終確定最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，單次提取時(shí)間30 min，提取2次，提取溫度35℃，固液比1∶20（g／mL），在此條件下綿茵陳綠原酸的收率為 109．9 mg(每 20 g 藥材）。

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