高效液相色譜法同時測定解郁安神顆粒中甘草苷及甘草酸含量*

樊寶娟，黃 艷，羅定強(qiáng)，吳 芳，楊亞麗，戴 涌

（陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065）

解郁安神顆粒由甘草、柴胡、大棗、石菖蒲、半夏、白術(shù)、浮小麥、遠(yuǎn)志、梔子、百合、膽南星、郁金、龍齒、酸棗仁、茯苓、當(dāng)歸16味中藥材經(jīng)提取加工而成，有疏肝解郁、安神定志功效，用于情志不暢、肝郁氣滯所致失眠、心煩、焦慮、健忘，神經(jīng)官能癥、更年期綜合征見上述證候者。方中甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥功效[1]。甘草的主要成分為三萜類與黃酮類成分，甘草苷及甘草酸則是這兩類化合物中重要的單體活性成分[2－3]。甘草酸有抗炎、抗病毒等作用，甘草苷有抗抑郁、神經(jīng)保護(hù)、肝臟毒性保護(hù)等作用[4－7]。為有效控制該藥品的質(zhì)量及確保藥效，節(jié)約檢驗(yàn)成本，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法在同一色譜系統(tǒng)中測定解郁安神顆粒中甘草酸及甘草苷的含量。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC－20AD 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Sartorius BS224S型電子天平，AE－240型電子分析天平（賽多利斯公司）；KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴箱（北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司）。

1．2 試藥

甘草酸對照品（批號為 110731－201418）、甘草苷對照品（批號為111610－201106）均購自中國食品藥品檢定研究院；192批解郁安神顆粒樣品均為2016國家評價性抽驗(yàn)抽樣所得，分別為14個生產(chǎn)企業(yè)的不同批次；甘草陰性對照及解郁安神顆粒自提樣品為陜西省食品藥品檢驗(yàn)所中藥室采用自購藥材按處方工藝提取所得；乙腈（美國天地公司）為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate XD－C18柱（250mm×4．6mm，5 μm）；流動相[8－10]：乙腈（A） －0．05% 磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表1）；檢測波長：237 nm；流速：1．0 mL ／min；柱溫：35℃。

表1 流動相梯度洗脫表

2．2 溶液制備

供試品溶液[11－15]：取樣品適量，研細(xì)，稱取 1 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

對照品溶液：取甘草苷對照品、甘草酸對照品適量，精密稱定，加70%乙醇分別制成每1 mL含甘草苷15 μg及甘草酸25 μg的溶液，即得。

陰性對照品溶液：取按處方和工藝制備的不含甘草的陰性樣品1 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專屬性考察：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μL，進(jìn)樣，記錄色譜圖。陰性對照品溶液色譜中，在與甘草苷、甘草酸對照品保留時間處無色譜峰，說明陰性對照無干擾，色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：精密吸取質(zhì)量濃度為13．68 μg／mL的甘草苷及質(zhì)量濃度為23．48 μg／mL的甘草酸對照品溶液 1，2，5，10，15，25 μL，分別注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果甘草苷回歸方程為 Y＝1 831．1 X＋20901，r＝0．9992(n＝6)，線性范圍為 13．68～342．00μg；甘草酸回歸方程為 Y＝290．0 X＋2 386．0，r＝0．996 8(n ＝6)，線性范圍為 23．48 ～ 587．00 μg。

精密度試驗(yàn)：精密吸取甘草苷質(zhì)量濃度為13．68μg／mL及甘草酸質(zhì)量濃度為 23．48 μg／mL的混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，按擬訂色譜條件測定峰面積。結(jié)果甘草苷、甘草酸峰面積的 RSD分別為0．36%和 1．18% （n＝ 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別于 0，5，10，15，20，25 h 時對供試品溶液進(jìn)行測定。結(jié)果甘草苷、甘草酸峰面積的 RSD分別為 1．19% ，0．90%（n ＝6）。表明甘草苷及甘草酸在供試品溶液中25 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品混合均勻，按上述方法制備6份供試品溶液，分別依法進(jìn)樣測定。結(jié)果甘草苷、甘草酸含量的 RSD分別為 1．16%和 1．01%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密量取已知含量的樣品（甘草酸含量為 1．00 mg ／g，甘草苷含量為 0．12 mg ／g）6 份，各 0．5 g，分別加入質(zhì)量濃度為 0．521 g／L的甘草酸對照品溶液1 mL及質(zhì)量濃度為0．034 g／L的甘草苷對照品溶液1 mL，同法制備供試品溶液，測定。結(jié)果見表2。

圖1 專屬性考察高效液相色譜圖

2．4 樣品含量測定

采用擬訂方法測定樣品，結(jié)果表明，不同批次、不同企業(yè)間的各個組分含量差異明顯。樣品總批次為192批，不合格 148批，不合格率為 77．08%，詳見表3。可見，8家企業(yè)不合格率大于95．00%，其余企業(yè)也均存在不同程度的不合格現(xiàn)象。提示企業(yè)在甘草投料中應(yīng)制訂定量指標(biāo)，加大把關(guān)力度，確保投料的準(zhǔn)確性。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表3 樣品判定結(jié)果統(tǒng)計表

3 討論

根據(jù)解郁安神顆粒的處方量及工藝，解郁安神顆粒中每袋理論含有甘草0．3 g，參照2015年版《中國藥典（一部）》甘草項(xiàng)下甘草酸及甘草苷含量規(guī)定，考慮水提取工藝，暫定樣品每袋含甘草苷（C21H22O9）不得少于0．45 mg，甘草酸（C42H62O16）不得少于 1．80 mg。

本研究中分別考察了甲醇、乙醇、70%甲醇為提取溶劑，結(jié)果以70%甲醇為溶劑時，提取最完全。另對檢測波長、柱溫、流動相等條件均進(jìn)行了探索，結(jié)果顯示，流動相為乙腈 －0．05% 磷酸溶液梯度洗脫，峰形和分離效果最佳，在237 nm波長處目標(biāo)物響應(yīng)值最大，且無干擾，柱溫在30，35，40℃時無明顯差異，故暫定柱溫為35℃。

綜上所述，采用本研究中新建立的方法，可快速測定解郁安神顆粒中甘草苷及甘草酸的含量，該方法精確度、效率及成本控制等方面也均有優(yōu)勢，為更好地控制該制劑質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)，也可為控制甘草藥材的治療量提供參考。

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