滇牡丹3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆與功能分析

朱金鑫， 孫金金， 原曉龍， 王 娟， 楊宇明， 王 毅

(1.西南林業大學林學院，云南昆明 650224； 2.云南省林業科學院，云南昆明 650201； 3.國家林業局重點開放性實驗室/云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育實驗室/云南省森林植物培育與開發利用重點實驗室，云南昆明 650201)

牡丹屬芍藥屬牡丹組，具有很高的觀賞和藥用價值[1-2]，牡丹籽油作為中藥丹皮(牡丹根皮)生產中的副產品，其食用藥用價值逐漸被人們發現，并不斷加強重視。研究人員發現，牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸，具有重要的研究價值和應用潛力[3]。滇牡丹(Paeoniadelavayi)主要分布在云南省中部至西北部、西藏自治區東南部和四川省西南部海拔 1 900～3 600 m的部分區域，是中國西南地區特有的珍稀種質資源，1992年中國植物紅皮書將滇牡丹列為漸危種，1996年中國野生植物保護條例將滇牡丹定為國家二級保護植物[4-7]。滇牡丹雖然自然分布狹窄，但其栽培范圍廣[4]，因此具有極大的引種馴化和育種空間，應用價值高。

超長鏈單不飽和脂肪酸(very long chain monounsaturated fatty acid，簡稱VLCMFA)是指主鏈上碳原子數≥18，有且僅有1個雙鍵的脂肪酸[8]。VLCMFA在生物體內參與生物膜膜脂、鞘脂的合成，是角質層蠟質生物合成的前體物質[9]，VLCMFA不僅在生物體內具有廣泛的重要作用，而且具有獨特的醫療保健、化工用途，高單不飽和脂肪酸食用油具有降血脂、保護心腦血管、促進嬰幼兒大腦發育等優點[10-11]，在工業上可以制備人造纖維、表面樹脂、油漆干性劑等重要化工原料[12-13]。VLCMFA在生物體內主要以油酸等單不飽和脂肪酸為底物，在脂肪酰-CoA延長酶復合體的催化下合成，其中脂肪酰-CoA延長酶復合體包括4個酶：3-酮酯酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase，簡稱KCS)、3-酮酯酰-CoA還原酶(3-ketoacyl- CoA reductase，簡稱KCR)、3-羥酯酰-CoA脫水酶(3-hydroxyacyl-CoA dehydrase，簡稱HCD)、羥酯酰-CoA還原酶(enoyl-CoA reductase，簡稱ECR)[14-15]，其中KCS催化步驟是其中的關鍵步驟[16]，因此被認為是VLCMFA生物合成途徑中的限速酶而得到廣泛研究。目前KCS已經在油菜[17-18]、大豆[19-20]、油桐[21]、油茶[22]等傳統油料作物中被廣泛研究，2011年中華人民共和國衛生部將牡丹籽油列入新資源食品后[23]，油用牡丹迅速成為研究熱點。本研究從滇牡丹中克隆得到KCS基因并進行生物信息學分析，為進一步研究其調控機制及獲得含高VLCMFA油用品種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

滇牡丹種子于2014年6—9月采集于云南省昆明市林業科學院樹木園苗圃，樣本經液氮速凍后于-80 ℃冰箱內保存待用。總RNA小量提取試劑盒購自美國Qiagen公司，pESY-T3克隆試劑盒與感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司，LA-Taq酶、反轉錄酶M-MLV購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1PdKCS基因的克隆 通過轉錄組分析獲得1個只含有部分滇牡丹KCS基因的序列片段，根據該基因片段序列設計特異性引物5′-RACE引物(本試驗所用引物見表1)對 5′-基因片段進行克隆。按照總RNA小量提取試劑盒操作步驟提取總RNA，檢測總RNA濃度及完整性后反轉錄合成cDNA第1鏈。按照試劑盒操作步驟擴增獲得PdKCS基因5′端序列片段，利用ATGC序列拼接軟件將5′-RACE獲得的基因片段和轉錄組數據分析獲得的基因片段進行拼接后獲得PdKCS全長基因序列。以PdKCS基因全長序列為模板，設計含有起始密碼子和終止密碼子的特異性引物PdKCSF、PdKCSR，以滇牡丹種子cDNA為模板，PdKCSF和PdKCSR為引物擴增PdKCS基因cDNA開放閱讀框全長序列，PCR反應體系參考PrimeScriptTMKit。擴增程序為： 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個循環； 72 ℃ 延伸7 min。將PCR產物轉入pESY-T3載體中送測序公司檢測并驗證。

1.2.2 生物信息學分析 應用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam)在線工具分析蛋白質理化性質；應用ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale/)在線工具進行蛋白質親疏水性預測分析；應用Tmpred(http：//www.ch.embnet.org/soft-ware/TMPRED_form.html)在線工具分析蛋白質序列跨膜結構域；應用Cell-PLoc(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/)進行亞細胞定位；應用NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blast和DNAMAN生物學軟件進行氨基酸多序列比對分析；利用軟件MEGA 5.0以鄰位連接法構建氨基酸序列的系統進化樹；數據使用GraphPad Prism v5.0進行分析制圖。

表1 引物序列

1.2.3 熒光定量PCR檢測PdKCS組織表達分析 以獲得的PdKCS基因序列為模板設計特異性引物PdKCSFt和PdKCSRt；分別采集滇牡丹授粉后30、50、70、90 d的種子，采集后立即放入液氮中。用RNA小量提取試劑盒提取滇牡丹不同發育時期的種子總RNA，電泳檢測后-80 ℃保存；參照反轉錄酶M-MLV試劑盒合成cDNA，保存于 -20 ℃；RT-PCR反應用熒光染料SYBR Green Ⅰ，GAPDH為內參基因。PCR反應體系20 μL，反應程序為：94 ℃ 4 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 25 s，35個循環；72 ℃單點檢測信號。反應結束后，60 ℃連續檢測信號產生溶解曲線。用Opticon monitor 3.1軟件進行數據的記錄和分析。每個樣品3次重復，滅菌水為空白對照。

2 結果與分析

2.1 PdKCS基因的克隆與序列分析

通過分析滇牡丹種子轉錄組獲得的KCS基因片段，依據獲得的基因片段設計5′-RACE基因擴增特異性引物，以cDNA為模板進行PCR擴增5′-RACE獲得基因片段，利用ATGC序列拼接軟件，最終獲得全長cDNA序列1 527 bp，命名為PdKCS，序列提交GenBank(登錄號KX524949)。利用NCBI ORF Finder軟件對拼接數據結果進行序列分析，結果顯示PdKCS基因片段包含完整的cDNA開放閱讀框，編碼502個氨基酸殘基的蛋白質，起始密碼子為ATG，終止密碼子TAA，并根據獲得的PdKCS基因全長設計含有起始密碼子和終止密碼子的特異性引物，以cDNA為模板擴增獲得PdKCS基因開放閱讀框，并將擴增產物連接到克隆載體中，進行永久保存。

2.2 PdKCS蛋白理化性質預測

蛋白理化性質分析結果顯示，PdKCS分子式為C2 534H4 008N688O709S23，相對分子質量為56 193.2，理論等電點為9.36，脂肪酸系數為96.1，親水性平均系數為-0.026，不穩定指數為40.61，該蛋白為堿性親水不穩定蛋白(圖1)。

PdKCS蛋白跨膜結構預測如圖2所示，亞細胞定位結果顯示PdKCS定位于質體膜。

2.3 PdKCS氨基酸序列比對分析

將克隆出來的PdKCS基因編碼的氨基酸蛋白序列與已報道的KCS的氨基酸序列進行多重序列比對。結果顯示，該蛋白與已報道的PdKCS含有KCS家族的高度保守區“PTPSLSAM”“FGNTSSSS”“GSGFKCNSAVW”和催化區域“GMGCSA”(圖3)，表明該蛋白屬于KCS家族蛋白。PdKCS的氨基酸序列與花生(Arachishypogaea)氨基酸序列(登錄號：ACZ51240.1)相似性達65.45%，與油茶(Camelliaoleifera)氨基酸序列(登錄號：ACQ41892.1)相似性達84.46%，與可可(Theobromacacao)氨基酸序列(登錄號：XP_007042184.1)相似性達85.46%，與樹棉(Gossypiumarboreum)氨基酸序列(登錄號：ALJ55536.1)相似性達81.3%。

2.4 PdKCS基因系統進化樹分析

利用MEGA 5.0軟件構建基于PdKCS氨基酸的系統進化樹(圖4)，結果表明，PdKCS與可可KCS(XP_007042184.1)聚為一類，親緣關系最近，與雙子葉植物聚為同一分支，與單子葉植物聚為不同分支，親緣關系最遠。由基因系統進化樹可知，雙子葉植物的KCS已經形成與單子葉植物親緣關系較遠的、相對獨立的家族，這與目前的研究結果相吻合。

2.5 熒光定量PCR檢測PdKCS

利用RT-PCR方法和PdKCS的基因特異性引物檢測其在授粉后30、50、70、90 d后種子中的表達情況(圖5)。使用GraphPad Prism v5.0進行數據分析， 結果顯示PdKCS的表達為雙峰型，在授粉后30 d時PdKCS的表達量達到第1個高峰，此后表達水平降低，在50 d后表達水平再次升高，在授粉后70 dPdKCS表達水平最高，而在種子發育后期，即授粉后70～90 d內，PdKCS表達水平降低，不飽和脂肪酸合成量降低，以積累飽和脂肪酸等物質以備萌發所需。

3 結論與討論

KCS是植物體內催化以油酸等單不飽和脂肪酸延長碳鏈產生超長鏈單不飽和脂肪酸生物合成途徑的的關鍵。本研究將轉錄組數據分析后克隆得到的滇牡丹KCS基因序列， 命名為PdKCS，GenBank登錄號為KX524949，包含完整的cDNA開放閱讀框，其開放閱讀框全長1 527 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼含502個氨基酸殘基的蛋白質。生物信息學分析結果顯示，PdKCS含有KCS蛋白家族的保守結構域，且與已報道的KCS具有高度一致性，表明該蛋白屬于KCS家族蛋白。蛋白理化性質分析結果顯示，PdKCS分子式為C2 534H4 008N688O709S23，相對分子質量為 56 193.2，理論等電點為9.36，脂肪酸系數96.1，親水性平均系數為 -0.026，不穩定指數為40.61，該蛋白為堿性親水不穩定蛋白，蛋白跨膜結構預測顯示該蛋白為跨膜蛋白，亞細胞定位結果顯示PdKCS定位于質體膜。

滇牡丹具有生態適應性強、栽培范圍廣等優點，因此滇牡丹具有極大的引種馴化和育種空間，牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸，具有重要的研究價值和應用潛力，因此選育出高單不飽和脂肪酸含量的油用滇牡丹品種并推廣種植，有利于促進地區林業的可持續發展。VLCMFA在生物體內主要以油酸等單不飽和脂肪酸為底物，在脂肪酰-CoA延長酶復合體的催化下合成，而脂肪酰-CoA延長酶復合體中的KCS被認為是VLCMFA生物合成途徑中的限速酶，對其深入研究有助于進一步了解VLCMFA的合成過程及調控機制。因此，PdKCS基因可作為未來滇牡丹油脂高產型新品種培育的調控研究重點。本研究從滇牡丹中克隆得到KCS基因并進行生物信息學分析，為進一步研究它的調控機制及獲得種子單不飽和脂肪酸含量高的油用滇牡丹品種，促進地區林業的可持續發展，創造巨大的經濟價值奠定理論基礎。

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