吡嘧磺隆對不同種群野慈姑生理生化指標的影響

芮 靜， 劉 英， 趙長山

(東北農業大學農學院，黑龍江哈爾濱 150030)

野慈姑(SagittariatrifoliaLinn.)別稱狹葉慈姑、三腳剪、水芋，多年生水生或沼生草本，為慈姑的變種，與慈姑相比，野慈姑植株較矮，葉片較小、薄。苗期為4～6月，花期為夏秋季，果期為秋季。塊莖或種子繁殖，分布于全國各地。野慈姑為水稻田常見雜草，北方部分水稻種植區，有時發生較重。吡嘧磺隆為水稻田常用除草劑，可以防除1年生和多年生闊葉雜草與莎草科雜草，如野慈姑，最適宜施藥時期是水稻的苗后早期。

乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，簡稱ALS)主要存在于高等植物的葉綠體基質中，是除草劑吡嘧磺隆的作用靶標。ALS活性下降能阻礙支鏈氨基酸、蛋白質的合成，影響植物細胞有絲分裂，同時導致植物組織失綠、黃化，破壞植物正常生長，使植物逐漸死亡[1]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)是植物體內的抗氧化酶，在保護生物膜系統免受活性氧傷害方面能發揮很重要的作用[1]。目前對這些酶活性在低溫、干旱、病蟲害等不利于植物生長的環境下發揮的保護作用報道很多[2-4]，也有試驗表明雜草種群SOD活性能反映雜草對除草劑的抗藥性。通過測定不同種群野慈姑的ALS活性、SOD活性和葉綠素含量，以期為研究吡嘧磺隆對野慈姑生理生化指標的影響提供一定的理論依據，在酶水平上初步探究野慈姑不同種群對吡嘧磺隆敏感性的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

于2014年春季在黑龍江省5個不同地區[雞東縣雞林朝鮮族鄉(H1)、鐵力市雙豐鎮衛東村(H2)、寶清縣和平村(H3)、五常市志廣鄉范家屯(H4)、雞東縣石河村(H5)]的水稻田采集野慈姑球莖。

供試藥劑為10%吡嘧磺隆可濕性粉劑(日產化學工業株式會社)。

試驗儀器主要有VXE380超低溫冰箱(賽默飛世爾公司)、MR23i高速冷凍離心機(法國Jouan公司)、HWS-28電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)、TU-1901紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 試驗方法

采用室外盆栽法，于2015年5月30日從不同地區采集的野慈姑球莖播于塑料盆中，塑料盆直徑為15 cm，每盆播種8粒球莖，播深3～5 cm，正常水分管理，并于2015年6月4日(野慈姑播種后但即將出土前)用吡嘧磺隆進行土壤封閉處理(9個)，施藥量分別為15、30、45、60、75、150、300、450、600 g a.i./hm2、，并設清水對照(CK)，共10個處理，每個處理重復3次。于施藥后7 d采取野慈姑挺水葉葉片為樣本，樣品取回后保存在-80℃的超低溫冰箱中待用。

1.2.1 乙酰乳酸合成酶活性的測定方法 參考隋標峰的方法[1]測定乙酰乳酸合成酶活性。

1.2.2 SOD酶活性的測定方法 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(nitro-blue tetrazolium，簡稱NBT)還原法[5]，至反應結束后，以不進行光照的對照管作空白對照，分別測定其他各管在560 nm處的吸光度，SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為1個酶活性單位表示。

1.2.3 葉綠素含量的測定方法 采用80%丙酮溶液法[6]，將采回的葉片用自來水洗凈擦干后吸去葉表水分，稱0.2 g樣品進行葉綠體色素提取。在分光光度計上測定葉綠素在波長為645、663 nm處的吸光度，然后根據以下公式分別計算葉綠素a、葉綠素b和葉綠素的總量：

葉綠素a濃度：Ca=12.72D663 nm-2.59D645 nm；

葉綠素b濃度：Cb=22.88D645 nm-4.67D663 nm；

葉綠素總濃度：Ct=Ca+Cb=20.29D645 nm+8.05D663 nm；

1.3 數據統計與處理

試驗原始數據均錄入Excel軟件后進行統計、計算分析。

2 結果與分析

2.1 吡嘧磺隆對乙酰乳酸合成酶活性的影響

由圖1可知，在不同地區采集的野慈姑種群的ALS活性隨著吡嘧磺隆用量的增加整體呈下降趨勢。野慈姑種群H5的ALS活性下降幅度最大，說明吡嘧磺隆對種群H5的抑制作用最大，H2次之，對吡嘧磺隆最不敏感的為種群H1。

在75 g a.i./hm2吡嘧磺隆劑量下，種群H2的ALS酶活性最低，為54.80%，種群H1的ALS活性最高，為 70.35%，說明在此劑量下，種群H2對吡嘧磺隆最為敏感，種群H1對吡嘧磺隆敏感性較低；在 600 g a.i./hm2吡嘧磺隆劑量下，H5的ALS活性最低，為17.63%，種群H1的ALS活性最高，為53.41%，說明在此劑量下，種群H5對吡嘧磺隆最為敏感，而種群H1對吡嘧磺隆最不敏感。

2.2 吡嘧磺隆對超氧化物歧化酶活性的影響

由表1可知，未使用吡嘧磺隆進行藥劑處理時，不同野慈姑種群自身SOD活性并不相同。SOD活性較高的是種群H1和H3，其次是種群H2，種群H4和種群H5的SOD活性相對偏低。

表1 吡嘧磺隆對不同野慈姑種群SOD活性的影響

注：同列數據后不同大寫、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著。

對野慈姑種群進行施藥處理，能夠使其體內SOD活性發生變化。吡嘧磺隆施藥量在15～75 g a.i./hm2范圍內，種群H1體內SOD活性與對照無顯著差異；施藥量在150～600 g a.i./hm2時，種群H1體內SOD活性與對照差異顯著，體內SOD活性有逐漸下降趨勢。吡嘧磺隆施藥量在15～75 g a.i./hm2范圍內，種群H2與對照差異極顯著，體內SOD活性呈波浪式變化。吡嘧磺隆施藥量在15～600 g a.i./hm2時，種群H3與對照未達到極顯著差異。種群H4在吡嘧磺隆施藥量15～60 g a.i./hm2范圍內與對照無顯著差異；在施藥量75～600 g a.i./hm2范圍內，與對照差異顯著(除 450 g a.i./hm2劑量外)。除吡嘧磺隆施藥量為 15 g a.i./hm2外，其他各處理的種群H5體內SOD活性均與對照有極顯著差異。

吡嘧磺隆對野慈姑種群H1、H2體內SOD活性影響較小，不同處理SOD活性水平相對較高，能在一定程度上減輕吡嘧磺隆對野慈姑的傷害；吡嘧磺隆對野慈姑種群H5體內SOD活性影響較大，減輕吡嘧磺隆對野慈姑傷害的能力較弱；種群H3、H4體內SOD活性在吡嘧磺隆施藥量較低時，能減輕對野慈姑的傷害，但在高濃度時，保護野慈姑的這種能力下降。

2.3 吡嘧磺隆對野慈姑葉綠素含量的影響

隨著吡嘧磺隆用藥量的增加，野慈姑葉片顏色逐漸褪綠黃化，嚴重時葉片向內卷曲、莖顏色褪綠黃化，但不同野慈姑種群的葉片褪綠黃化程度不同。由圖2可知，施藥后7、15、21 d野慈姑體內葉綠素含量隨吡嘧磺隆用量的增加整體呈下降趨勢。

施藥后7 d，除種群H4在吡嘧磺隆施藥量為15、30 g a.i./hm2，種群H5在吡嘧磺隆施藥量15 g a.i./hm2時的葉綠素含量高于對照外，其他處理的葉綠素含量均低于對照。與對照葉綠素含量相比，葉綠素含量下降最多的是種群H1，最少的是種群H4。

施藥后15、21 d，隨著施藥量的增加，不同種群的葉綠素含量整體均呈逐下降趨勢。施藥后15 d，與對照葉綠素含量相比，葉綠素含量下降最多的是種群H1，其次是種群H3，最少的是種群H4；施藥后21 d，與對照葉綠素含量相比，葉綠素含量下降最多的是種群H4，其次是種群H2，最少的是種群H1。說明吡嘧磺隆能夠在一定程度上降低種群葉片中的葉綠素含量，從而影響植物的光合作用。

3 結論與討論

ALS活性是鑒定雜草對ALS抑制劑產生抗性的重要生理生化指標。崔海蘭在播娘蒿對苯磺隆的抗藥性研究中明確指出，與敏感種群相比，抗藥性種群的ALS對苯磺隆的敏感性下降，且抗藥性生物型的ALS 序列在相對于197位的脯氨酸上發生了突變[7]；Hwang等在研究抗ALS抑制劑的鴨舌草時明確指出，鴨舌草對其不敏感[8]。本研究結果表明，在施藥量為15～600 g a.i./hm2范圍內，不同種群體內ALS活性隨著吡嘧磺隆施藥量的增加而下降，下降幅度最大的是種群H5，其體內ALS活性從86.04%下降到17.63%；降低幅度最小的是種群H1，其體內ALS活性從98.24%降低到53.41%。

隨著吡嘧磺隆施藥量的增加，不同種群SOD活性變化幅度不同，種群H1自身SOD活性偏高，而種群H5自身SOD活性偏低。說明SOD活性的變化不是影響野慈姑產生抗性的主要因素。

施藥后7、15、21 d后，野慈姑體內葉綠素含量基本呈下降趨勢，隨著時間的推移，吡嘧磺隆對野慈姑體內的葉綠素含量抑制作用加大。

每年都會增加一定數量的抗藥性雜草，雜草的抗藥性問題應得到密切關注[9-10]。在抗藥性雜草治理方面，應多汲取前人的經驗，除加強抗藥性雜草的檢測和抗藥性機制方面外，應多注意除草劑的交替、輪換使用，延緩抗藥性雜草的發生，延長除草劑的使用期限等[11]。充分掌握雜草的生物學特性，使之與農業耕作措施相結合，更能從根本上解決抗藥性雜草發生的問題。

[1]隋標峰. 麥田雜草對苯磺隆敏感性差異的生理生化機制研究[D]. 泰安：山東農業大學，2007.

[2]丁 偉，陶 波，程 茁，等. 甜菜對豆磺隆敏感性與質膜過氧化關系的研究[J]. 東北農業大學學報，2005，36(5)：556-560.

[3]吳進才，劉井蘭，沈迎春. 等. 農藥對不同水稻品種 SOD 活性的影響[J]. 中國農業科學，2002，35(4)：451-456.

[4]張沙艷，高成華. 玉米超氧化物岐化酶(SOD)的分離及純化[J]. 沈陽師范大學學報(自然科學版)，2006，24(2)：231-233.

[5]張志良，瞿偉菁. 植物生理學實驗指導[M]. 3版. 北京：高等教育出版社，2003：268-269.

[6]王學奎，黃見良. 植物生理生化實驗原理與技術[M]. 3版. 北京：高等教育出版社，2015：131-133.

[7]崔海蘭. 播娘蒿(Descurainiasophia)對苯磺隆的抗藥性研究[D]. 北京：中國農業科學院，2009.

[8]Hwang I T，Lee K H，Park S H，et al. Resistance to acetolactate synthase inhibitors in a biotype ofMonochoriavaginalisdiscovered in Korea[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2001，71(2)：69-76.

[9]左平春，臧曉霞，陳仕紅，等. 稻稗對唑酰草胺的非靶標抗藥性和對氰氟草酯的交互抗藥性[J]. 雜草學報，2016，34(4)：28-32.

[10]顏欣茹，楊俊雪，薛 君，等. 抗性和敏感生物型菵草代謝精唑禾草靈的速度差異[J]. 雜草學報，2017，35(1)：15-19.

[11]李平生，魏松紅，紀明山，等. 野慈姑對ALS抑制劑的交互抗藥性[J]. 農藥，2015，54(5)：366-368.