微流控技術在病原學檢測中的應用綜述

宋波　王橋　張曉杰

【摘要】微流控芯片，又稱芯片實驗室，是一種以在微米尺度空間對流體進行操控為主要特征的技術平臺，微流控技術是一個由物理、化學、微加工技術與生物技術等學科組成的交叉領域，微型化、集成化的微流控芯片具有高效、快速、樣品和試劑用量少等優點，促進了其在病原體檢測中的應用。對傳統方法以及微流控芯片在病原體檢測中的應用進行綜述，并提出了微流控技術研究的優勢。

【關鍵詞】微流控芯片 病原體 檢測微流控芯片，也被稱為微全分析系統，是將常規實驗室中的加樣、反應、分離檢測等基本操作在一塊幾平方厘米（甚至更小）的芯片上進行的方法，可以取代常規生物或化學實驗室各種功能的一種高新技術平臺。本文將現有病原微生物檢測方法與微流控芯片方法進行對比，針對該領域在病原微生物檢測方面的主要研究難點和發展趨勢進行了討論。

一、現有的微生物檢測技術

病原微生物的檢測標準是培養法，此法簡單、直觀、費用低，但該法耗時、操作繁瑣、靈敏性低，對操作人員要求高。免疫分選技術是利用抗原-抗體的特異性反應，在檢測微生物中應用非常廣泛，可定量檢測樣本中的微生物，但該法仍存在耗時、操作繁瑣、試劑耗量大的缺點，不能滿足臨床對感染性疾病快速診斷的需求。

聚合酶鏈反應（PCR）等分子生物學檢測法具有高度的特異性和靈敏度，檢測特異性基因片段從而達到多種病原菌的鑒定的目的，但本法存在過度敏感，假陽性率高，較復雜的樣本需要預處理等缺點，準確性和特異性不高。

二、微流控芯片技術中常用的病原菌檢測分析技術

1.免疫分選技術

將免疫分選與微流控芯片技術結合是近年來的研究熱點，該法反應體積在微升級，樣品和試劑耗量減少，提高了分選效率，芯片全程可控，簡化了操作流程，樣品擴散距離縮短，節省了反應時間，其高通量、高集成的特點，實現了對不同目標菌的特異性分選和富集。

免疫分選技術主要包括三種方法：微通道免疫分選、免疫微珠分選和免疫磁珠分選。

微通道免疫分選是在微通道內壁表面使用物理吸附或化學結合的方法固定抗體或其類似物，再向芯片內加入待檢樣品，實現微生物的特異性捕獲檢測。Boehm等設計并制作了了微流控生物傳感器，在芯片上多個微室表面上修飾不同的特異性抗體，從而達到了同時檢測不同種類微生物的目的。該法的缺點是處理步驟較繁瑣，分選效率較低。

免疫微珠分選技術使用玻璃微珠進行特異性抗體吸附，Varshney等設計微通道深度與微珠直徑尺寸相近，使得微珠在微通道中單層排列，將捕獲有大腸桿菌特異性抗體的免疫微珠填充于微通道中，利用化學發光法檢測微珠表面的大腸桿菌含量。由于微珠有更大的比表面積，因此能將更多的特異性抗體固定于一定表面上。但本法為了有效防止微珠在腔內重疊造成光信號的阻滯，微珠必須呈單層排列，因此芯片的制備具有一定的難度。

免疫磁分選技術利用安裝于微通道附近的電磁場發生器俘獲磁珠，較微珠分選法更具自動化和靈活性。Pivetal等設計一個 S型微通道的芯片，在磁珠表面上修飾特異性抗體，對樣本中目標微生物的檢測率達到了 98.46%。本法的缺點是，磁珠價格昂貴，實驗需要產生磁場的裝置，因此本研究并不利于批量生產，限制了其發展成為臨床即時檢測設備。

2.基于核酸的熒光檢測

本法將PCR與微流控芯片結合，將自動變溫的加熱器集成在微型反應室上，實現樣品液在特定反應室中變性、退火和延伸，通過對擴增產物熒光標記，實現對待檢菌特異片段的實時定量分析。Lee通過這種方法完成登革熱病毒、腸道病毒71的分選和RNA病毒的檢測，檢測限可達到10-102PFU/m L。該方法雖然特異性和靈敏度很高，但對核酸蛋白質的直接檢測鑒定更具有說服力。

三、展望

微流控芯片集成度高、準確性好、試劑消耗低、反應速度快，其要素涵蓋小型化實驗的基本過程，如樣品分離、純化、試劑混合、探針雜交或合成以及樣品檢測等。隨著新技術的發展和信息化水平的提高，微加工技術的迅速發展，微流控芯片發展成為即時檢測和診斷儀器將成為極大的可能，在臨床病原體的早期診斷及藥敏試驗等應用中，具有極大的潛力。

此外，微流控芯片即時檢測儀器的檢測診斷對象由現有的血糖、肺結核、HIV、心臟標志物等向外大幅延拓，有望覆蓋體育競技、海關口岸、應急輔助醫療等諸多領域，這項技術未來將發展成為檢驗科最重要的研究方法之一。

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