血清結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因-1在胃癌患者化療療效預(yù)測(cè)中的效果

陳　莉

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

胃癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均位于所有惡性腫瘤的前5位[1]。根據(jù)2015年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)報(bào)告[2], 每千人新增癌癥患者中就有679人被診斷為胃癌，每千人癌癥死亡患者中有498例死于胃癌。晚期胃癌預(yù)后差, 5年生存率不足10%。目前外科手術(shù)切除是胃癌主要的根治手段，而對(duì)Ⅳ期及非根治術(shù)、術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的晚期患者而言，化療是主要的治療方法。目前臨床上仍存在部分患者不能從化療中受益，無(wú)法早期判斷化療療效。MACC1是由Stein等[3]對(duì)結(jié)腸黏膜、結(jié)腸癌原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶通過(guò)差異分析基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)的，其與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且高表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞體外增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。除了發(fā)揮促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移作用外, MACC1還與腫瘤的糖代謝有關(guān)。Lin L等[4]研究發(fā)現(xiàn), MACC1可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的葡萄糖無(wú)氧酵解過(guò)程(warburg效應(yīng))，并且在各種應(yīng)激因子(代謝應(yīng)激、化療、放療等)作用下，反應(yīng)性增高，增高后的MACC1可通過(guò)促進(jìn)warburg效應(yīng)抗凋亡促增殖。因此，血清MACC1有可能作為胃癌臨床化療療效早期預(yù)測(cè)的有效指標(biāo)[5]。本研究探討MACC1 在胃癌患者對(duì)5-Fu為基礎(chǔ)的化療耐藥中的作用及其與化療療效的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1　材料與試劑

人胃癌細(xì)胞系BGC-823、MACC1 ELISA試劑盒、RMPI-1640 培養(yǎng)基、胰酶、嘌呤霉素等購(gòu)于武漢庫(kù)克金生物科技有限公司，胎牛血清購(gòu)于武漢柏能達(dá)科生物科技有限公司，采購(gòu)SYBR, 含MACC1過(guò)表達(dá)和干擾的重組慢病毒顆粒, MACC1和GAPDH上下游引物。

1.2　臨床資料

選取2016年1月—2017年4月本院診治的40例晚期胃癌初治患者治療前血清樣本。所有患者均經(jīng)病理學(xué)診斷為胃腺癌。入院常規(guī)檢查包括血常規(guī)、肝腎功能、腹部CT等。其中男28例，女12例，平均年齡(53.0±6.58)歲。化療方案為以5-氟尿嘧啶(5-Fu)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，化療周期為4～6周。

1.3　細(xì)胞培養(yǎng)與穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建

人胃癌細(xì)胞株BCG-823常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基中，置于 37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至90%, 即對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)胰酶消化，取2 mL接種于六孔板中，細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)50% 時(shí)，用含過(guò)表達(dá)(pLV-Puro-MACC1)和干擾(pLVshRNA-Puro-MACC1) MACC1的慢病毒顆粒分別感染BCG-823細(xì)胞，感染48 h后用含嘌呤的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，濃度為0.5 μg/mL, 每2天更換一次培養(yǎng)基，設(shè)置正常BCG-823細(xì)胞為對(duì)照組，第5天撤去藥物，得到過(guò)表達(dá)MACC1細(xì)胞株pLV-MACC1/BCG-823和干擾MACC1細(xì)胞株pLVsh-MACC1/BCG-823, 擴(kuò)增細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4　RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中MACC1的mRNA表達(dá) 水平

Trizol法提取對(duì)照組(BCG-823), 過(guò)表達(dá)組(pLV-MACC1/BCG-823)和干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)的胃癌細(xì)胞總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, 以得到的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，以GAPDH為內(nèi)參。MACC1上游引物序列為5＇-ATCCGCCACACATGCTTAA-3＇, 下游引物序列為5＇-CTTCAGCCCCAATTTTCATC-3＇, GAPDH上游引物序列為5＇-A CCACAGTCCATGCCATCAC-3＇, 下游引物序列為5＇-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3＇。反應(yīng)體系如下: SYBR Premix Ex Taq(2x)10 μL, 基因上游引物(10μmol/L) 0.5 μL, 下游引物(10μmol/L) 0.5 μL, 模板1 μL, ddH2O補(bǔ)足至20 μL; 反應(yīng)條件為: 95 ℃變性30 s, 95 ℃ 5 min, 55 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 重復(fù)40個(gè)循環(huán)。每組樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，將同一樣本中目的基因的Ct值減去GAPDH的Ct值，得到目的基因的△Ct值。2(-△Ct)即為目的基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量。

1.5　通過(guò)ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液、胃癌病人 血清中MACC1蛋白表達(dá)水平

待對(duì)照組(BCG-823), 過(guò)表達(dá)組(pLV-MACC1/BCG-823)和干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)的細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，小心收集各組細(xì)胞上清液，低溫離心后-80 ℃保存; 用血清分離管抽取胃癌患者外周血5 mL, 室內(nèi)凝結(jié)30 min后, 1 000×g低溫離心15 min, 取上清-80 ℃保存。按照 ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)MACC1蛋白表達(dá)水平，具體為: 將不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，樣品和空白對(duì)照各100 μL加到包被MACC1抗體的96空板上37 ℃孵育2 h, 吸凈每孔，然后用洗滌緩沖液洗滌3次。然后每孔加100 μL抗體檢測(cè)液, 37 ℃孵化2 h。吸干每個(gè)孔，洗滌緩沖液洗滌3次，每孔加入100 μL的檢測(cè)試劑A, 37 ℃孵育2 h, 再次洗滌后，每孔加入100 μL的底物稀釋液, 37℃避光孵育15 min后每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)。輕輕拍打混勻后, 30 min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，在450 nm處讀取每個(gè)孔OD值，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.6　MTT 法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組(BCG-823), 過(guò)表達(dá)組(pLV-MACC1/BCG-823)和干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)細(xì)胞鋪96孔板，每孔加入100 μL, 細(xì)胞密度為9 000個(gè)/孔，過(guò)夜培養(yǎng)后棄去上清，加入不同濃度的5-Fu, 設(shè)7個(gè)濃度梯度，分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL, 每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)終止培養(yǎng)，繼續(xù)孵育4 h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min, 使結(jié)晶物充分溶解。在490 nm處檢測(cè)各孔的吸光度OD值，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)。

1.7　化療療效評(píng)定

根據(jù)治療前后胃癌患者影像學(xué)資料(增強(qiáng)CT)評(píng)價(jià)化療療效，采用實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)RECIST 1.1[6]。完全緩解(CR): 所有靶病灶消失，全部病例淋巴結(jié)(包括靶結(jié)節(jié)和非靶結(jié)節(jié))短徑必須減少至<10 cm; 部分緩解(PR): 靶病灶直徑之和比基線水平減少至少30%; 疾病進(jìn)展(PD): 靶病灶直徑之和相對(duì)增加至少20%; 疾病穩(wěn)定(SD): 靶病灶減小或增加的程度介于PR和PD。疾病控制率(DCR)= CR+PR+SD。

1.8　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析( One-way ANOVA), 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1　生存分析

作者在KM plotter數(shù)據(jù)庫(kù)[7-8]中分析發(fā)現(xiàn), MACC1的表達(dá)量和預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)，在mRNA水平上, MACC1低表達(dá)的患者的總生存時(shí)間顯著高于MACC1高表達(dá)患者(P<0.05), 見圖1。同時(shí)分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中MACC1在不同期別病人中的表達(dá)量的差異[9], 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其在不同期別病人中的表達(dá)量存在差異，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與正常組織相比, MACC1的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05), 見圖2。

2.2　RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中MACC1的mRNA 表達(dá)水平

RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組(BCG-823)相比，過(guò)表達(dá)組(pLV-MACC1/BCG-823)細(xì)胞中mRNA水平顯著上調(diào)，干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)細(xì)胞的MACC1 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 基于KMplotter數(shù)據(jù)庫(kù)的胃癌患者生存曲線

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中MACC1在不同期別病人中的表達(dá)量的差異

圖3 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中MACC1的mRNA表達(dá)水平

2.3　ELISA法檢測(cè)細(xì)胞株培養(yǎng)液中MACC1蛋白 表達(dá)水平

ELISA檢測(cè)對(duì)照組(BCG-823)、過(guò)表達(dá)組(pLV-MACC1/BCG-823)和干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)細(xì)胞培養(yǎng)液中MACC1水平，過(guò)表達(dá)組(pLV-MACC1/BCG-823)細(xì)胞培養(yǎng)液中MACC1蛋白水平較其他兩組明顯升高，而干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)細(xì)胞培養(yǎng)液中的MCCC1蛋白水平明顯降低，低于對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 與細(xì)胞中MACC1 mRNA水平呈正相關(guān)。見圖4。

圖4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞株培養(yǎng)液中MACC1蛋白表達(dá)水平

2.4　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性影響

加入不同濃度的5-Fu藥物作用48 h后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組(BCG-823), 過(guò)表達(dá)組(pLV-MACC1/BCG-823)和干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)隨著藥物濃度的增加而減少，且三組細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性存在差異。過(guò)表達(dá)組(pLV-MACC1/BCG-823)細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性最差，當(dāng)干擾MACC1后, BCG-823細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性增加，細(xì)胞存活率降低。5-Fu藥物濃度越大，其抑制干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)細(xì)胞增殖作用越明顯，高于對(duì)照組(BCG-823)和過(guò)表達(dá)組(pLV-MACC1/BCG-823), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 不同5-Fu濃度下細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的差異

2.5　療效評(píng)價(jià)

根據(jù)增強(qiáng)CT進(jìn)行臨床化療療效評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，臨床上晚期胃癌患者對(duì)以5-Fu為基礎(chǔ)的化療療效存在差異。療效評(píng)價(jià)為PR和PD的2例患者CT結(jié)果顯示患者行胃癌根治術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，予以化療。化療前，患者門靜脈主干栓子形成和肝臟轉(zhuǎn)移，化療后可見門靜脈海綿樣變性，肝臟轉(zhuǎn)移灶變小，化療療效好。而診斷為初治胃癌肺轉(zhuǎn)移患者化療后肺轉(zhuǎn)移病灶無(wú)明顯變化，胃原發(fā)病灶進(jìn)展，化療療效差。

2.6　ELISA法檢測(cè)患者血清中MACC1蛋白表達(dá) 水平

ELISA法檢測(cè)不同胃癌患者治療前血清中MACC1蛋白含量，作者發(fā)現(xiàn)不同患者的血清樣本中的MACC1水平存在差異。結(jié)合化療后影像學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化療前血清MACC1含量低的患者對(duì)以5-Fu為基礎(chǔ)的化療效果較好，而MACC1含量高的患者的化療療效較差，見表1。

表1　晚期胃癌患者化療前血清 MACC1

與疾病進(jìn)展組相比, *P<0.01。

3　討　論

目前，胃癌是全世界常見的致死性腫瘤之一，每年約有70萬(wàn)人死于胃癌，尤其在亞洲東部國(guó)家[10]。在中國(guó)，每年就有超過(guò)40萬(wàn)人被診斷為胃癌，死亡人數(shù)超過(guò)新發(fā)病例的一半。胃鏡在臨床上的普遍使用使得胃癌的早期診斷率有了很大的提高，但是大部分患者在診斷時(shí)已是晚期，中位生存期不超過(guò)一年[11-12], 且胃鏡屬于侵入性檢查，其作為常規(guī)檢查手段不為大部分患者所接受，因此在西方國(guó)家，仍有80%診斷為胃癌的患者臨床分期為Ⅳ期[13]。目前胃癌的主要治療手段為手術(shù)治療，輔以化療或放療，但治療后仍有很高的腫瘤復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率。臨床癥狀復(fù)發(fā)，診斷較晚期，缺乏個(gè)體化精準(zhǔn)治療的評(píng)估策略使得胃癌的死亡率居高不下[14]。遺傳病因?qū)W，組織學(xué)等分子特征的差異導(dǎo)致胃癌患者對(duì)化療敏感性存在較大差異[15], 晚期患者化療或靶向治療后的五年生存率不超過(guò)5%。因此，尋找能夠預(yù)測(cè)化療療效的高效應(yīng)、低損傷的生物標(biāo)記物就顯得尤為迫切。

結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因-1(MACC1)功能的發(fā)揮主要依賴于SH3結(jié)構(gòu)域和SH3結(jié)合位點(diǎn)，這兩種結(jié)構(gòu)對(duì)下游c-Met的激活十分關(guān)鍵[16], 此外, MACC-1羧基端兩個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域調(diào)控炎癥、凋亡以及侵襲等生物學(xué)過(guò)程[17]。最初MACC1的研究局限于其對(duì)結(jié)腸癌侵襲遷移的作用，近年來(lái)MACC1也被發(fā)現(xiàn)在肝癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤以及卵巢癌等腫瘤組織中高表達(dá)，與患者不良預(yù)后相關(guān)[18-25], 可以預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。Wang L等[26]報(bào)道MACC1在胃癌的表達(dá)水平高于正常組織，并發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，控細(xì)胞周期的作用。目前有關(guān)MACC1對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究很廣泛，但主要集中在組織及細(xì)胞水平，急需尋找一種即時(shí)、便捷、無(wú)創(chuàng)的方式檢測(cè)MACC1的表達(dá)進(jìn)而早期預(yù)測(cè)胃癌患者化療療效及預(yù)后。

本研究構(gòu)建MACC1過(guò)表達(dá)、低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系pLV-MACC1/BCG-823和pLVsh-MACC1/BCG-823, 檢測(cè)細(xì)胞中MACC1 mRNA水平確認(rèn)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功并比較不同細(xì)胞內(nèi)MACC1 mRNA的差異。檢測(cè)細(xì)胞上清中MACC1蛋白含量并與mRNA水平對(duì)比，并比較不同細(xì)胞分泌的MACC1含量的差異。過(guò)表達(dá)組(pLV-MACC1/BCG-823)細(xì)胞分泌的MACC1蛋白水平明顯高于干擾組(pLVsh-MACC1/BCG-823)和對(duì)照組(BCG-823), 并且和細(xì)胞內(nèi)MACC1 mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致，證明胃癌細(xì)胞分泌的MACC1蛋白水平與細(xì)胞中MACC1水平呈正相關(guān)，這為通過(guò)檢測(cè)血清MACC1水平了解胃癌惡性生物學(xué)行為奠定了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)作者發(fā)現(xiàn)，三種細(xì)胞株對(duì)5-Fu敏感性存在差異。當(dāng)干擾MACC1后, BCG-823細(xì)胞對(duì)5-Fu敏感性增加，細(xì)胞存活率降低，上調(diào)MACC1后, BCG-823對(duì)5-Fu的敏感性降低。通過(guò)檢測(cè)40例晚期胃癌患者治療前血清中MACC1水平發(fā)現(xiàn)，化療前不同患者血清中的MACC1含量存在差異。通過(guò)影像學(xué)資料對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，化療前MACC1含量低的患者化療療效優(yōu)于MACC1含量高的患者，這提示MACC1可以先于CT預(yù)測(cè)胃癌患者對(duì)以5-Fu為基礎(chǔ)的化療療效。因此，血清MACC1有可能作為胃癌臨床化療療效早期預(yù)測(cè)的有效指標(biāo)。

Stein等[27]通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌患者血液中循環(huán)MACC1的mRNA水平來(lái)預(yù)測(cè)高危結(jié)腸癌病人。Wang G等[25]通過(guò)檢測(cè)胰腺癌病人血清中的MACC1含量發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥作用，但有關(guān)胃癌血清中MACC1的表達(dá)水平與化療耐藥、病人預(yù)后的關(guān)系未見報(bào)道。本文通過(guò)過(guò)表達(dá)、干擾MACC1測(cè)定胃癌細(xì)胞株對(duì)5-Fu耐藥的影響，通過(guò)檢測(cè)血清中MACC1含量，闡明血清MACC1水平是胃癌化療療效評(píng)價(jià)的即時(shí)、便捷、無(wú)創(chuàng)的生物標(biāo)志物，將為尋求新的胃癌化療療效預(yù)測(cè)指標(biāo)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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