泰山磐石散降低流產(chǎn)模型大鼠流產(chǎn)率的機(jī)制研究

高曉雷 ，劉 廣 ，朱尚文 ，湯麗玉 ，陳麗麗 ，陳 鑫 ，江 澍

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

自然流產(chǎn)（spontaneous abortion，SA）指妊娠在28周前，非人為原因引起的流產(chǎn)，有關(guān)報(bào)道在孕期過(guò)程中發(fā)生自然流產(chǎn)的比率為50%～60%。反復(fù)自然流產(chǎn)（RSA）是指連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)，發(fā)病率約為妊娠總數(shù)的1%～5%，是生殖醫(yī)學(xué)中最令人沮喪和困難的領(lǐng)域之一［1-2］。SA病因復(fù)雜，例如遺傳缺陷、子宮畸形、內(nèi)分泌功能異常、感染、抗磷脂綜合征等均可導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生，其中由內(nèi)分泌因素引起的早期流產(chǎn)中，性腺軸系統(tǒng)分泌激素異常是重要因素之一［3-4］。SA在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬于“滑胎”范疇，中醫(yī)藥安胎歷史悠久，其中泰山磐石散就是安胎的代表方劑之一。此方具有健脾益氣，調(diào)補(bǔ)沖任，養(yǎng)血安胎的作用，是中醫(yī)臨床常用的保胎安胎經(jīng)典方劑，并在中醫(yī)臨床中已經(jīng)得到充分證實(shí)，具有顯著療效［5-9］。溴隱亭所造流產(chǎn)模型大鼠具有類似人類流產(chǎn)的催乳素分泌降低、黃體酮（P）分泌減少等特點(diǎn)［10-12］，本實(shí)驗(yàn)采用溴隱亭所造的流產(chǎn)模型大鼠存在外周血P水平下降及胎仔流產(chǎn)率升高現(xiàn)象，提示所造流產(chǎn)模型成功。本研究通過(guò)泰山磐石散對(duì)流產(chǎn)模型大鼠的干預(yù)來(lái)觀察外周血雌二醇 （E2）、P水平的變化以及蛻膜組織母胎界面雌激素受體α（ERα）的表達(dá)情況，了解上述指標(biāo)對(duì)該流產(chǎn)模型大鼠早期妊娠的影響，為進(jìn)一步探討中藥治療SA的相關(guān)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD大鼠45只，SPF級(jí)，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)：2015000527009，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，分別將2只雌鼠和1只雄鼠合籠。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 泰山磐石散（購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院）；溴隱亭（2.5 mg／片，瑞士諾華制藥有限公司）；烏拉坦（上海伊卡生物技術(shù)有限公司）；大鼠雌、孕激素ELISA試劑盒（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；兔抗鼠ERα多克隆抗體（美國(guó) Santa Cruz公司）；ultrasensitiveTMS-P超敏試劑盒（鼠／兔）、DAB顯色試劑盒（福州邁新生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；-80℃超低溫冰箱（美國(guó) Thereto Fisher公司）；半自動(dòng)石蠟切片機(jī)（德國(guó)MICROM公司）；生物組織包埋機(jī)、生物組織烤片機(jī)（孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)公司）；顯微鏡用數(shù)碼相機(jī)等（日本Nikon公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法及指標(biāo)檢測(cè)

2.1 藥物制備 溴隱亭混懸液：溴隱亭4片用稱量紙包裹研磨后溶于25 mL 75%乙醇，配制成濃度為0.4 mg／mL的混懸液。泰山磐石散：人參9 g，黃芪 9 g，白術(shù) 4.5 g，炙甘草 4.5 g，當(dāng)歸 9 g，川芎 7.2 g，白芍 7.2 g，熟地黃 7.2 g，川續(xù)斷 9 g，黃芩 9 g，砂仁4.5 g，糯米18 g。將所有藥物混合（除砂仁），加入1 000 mL自來(lái)水，浸泡30 min，然后大火煎開(kāi)，小火再煎25 min，然后加入砂仁繼續(xù)煎煮5 min；藥渣中再加入500 mL自來(lái)水，重復(fù)以上操作1次；將兩次所得藥液過(guò)濾后濃縮到98.1 mL，制成藥物濃度為1g／mL的溶液。以上制備好的液體 4℃保存，1周內(nèi)使用。

2.2 大鼠分組及給藥方法 于下午5點(diǎn)將30只雌性SD大鼠和15只雄性SD大鼠分別以2只雌鼠和1只雄鼠合籠過(guò)夜，次日8∶00進(jìn)行陰道圖片檢測(cè)，以在顯微鏡中發(fā)現(xiàn)精子或觀察到陰栓記為妊娠第1天。然后分為正常組、模型組、干預(yù)組各10只。正常組：孕第1～11天每天灌服蒸餾水10 mL／（kg／d），孕第6～8天每天皮下注射75%乙醇溶液1 mL／（kg／d）；模型組：孕第 1～11 天每天灌服蒸餾水 I0 mL／（kg／d）， 孕第 6～8天每天皮下注射溴隱亭 0.4 mg／（kg／d）；干預(yù)組：孕第 1～11 天每天灌服泰山磐石散湯劑 10 mL／（kg／d），孕第 6～8 天每天皮下注射溴隱亭 0.4 mg／（kg／d）。

2.3 大鼠取材 于孕第12天，腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉孕鼠 （劑量為5 mL／kg），待孕鼠麻醉后，剖開(kāi)腹腔，觀察妊娠情況，計(jì)算大鼠子宮內(nèi)的胎仔存活、死亡數(shù)量及流產(chǎn)率；腹主動(dòng)脈采血，裝于無(wú)任何添加劑的負(fù)壓采血管中，常溫放置2 h，等采血管中的血液凝固后，將離心管放在高速離心機(jī)中3 000 rpm離心15 min，取上清液于高壓過(guò)的EP管中封存，保存于-80℃低溫冰箱；剪取胎盤蛻膜組織，置于PBS緩沖液中洗滌，用濾紙吸干后放入4%多聚甲醛溶液中固定12～24 h后包埋，以待后用。

2.4 3組大鼠妊娠情況 正常妊娠：子宮呈粉紅色，宮腔內(nèi)未見(jiàn)明顯出血點(diǎn)，胚胎發(fā)育良好，大小均勻，胎盤附著處無(wú)淤血；流產(chǎn)：子宮呈暗紅色，胚胎大小不一，宮腔內(nèi)可見(jiàn)黑色淤血點(diǎn)，特別是胚胎附著處，有的胚胎可出現(xiàn)被吸收的情況。每只大鼠計(jì)算流產(chǎn)率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 3組大鼠外周血E2、P含量的測(cè)定 分別采用大鼠雌孕激素ELISA試劑盒檢測(cè)外周血中E2、P含量，并參照該試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.6 3組大鼠蛻膜組織母胎界面ERα表達(dá)分布情況 用免疫組織化學(xué)S-P法分析母胎界面ERα的表達(dá)分布情況，參照ultrasensitiveTMS-P超敏試劑盒（鼠／兔）說(shuō)明書(shū)操作。將組織切片放到顯微鏡下觀察，蛻膜組織細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒視為ERα表達(dá)。在蛻膜組織母胎界面的子宮側(cè)和胚胎側(cè)隨機(jī)選取5個(gè)等大區(qū)域，用圖像分析軟件Image-Pro Plus進(jìn)行半定量分析，分別計(jì)算子宮側(cè)、胚胎側(cè)的平均光密度及二者差值（胚胎側(cè)－子宮側(cè)）和總和（胚胎側(cè)＋子宮側(cè)），然后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

平均光密度＝累計(jì)光密度／選擇區(qū)域面積

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以（x±s）表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，3組比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 3組流產(chǎn)率比較 見(jiàn)表1。

表1 3組流產(chǎn)率比較（x±s）

3.2 3組外周血E2、P含量比較 見(jiàn)表2、圖1、圖2。

表 2 3 組外周血 E2、P 含量比較（x±s）pg／mL

圖1 3組外周血E2含量

圖1 3組外周血P含量

3.3 3組蛻膜組織母胎界面平均光密度比較 見(jiàn)表 3、圖 3。

4 討 論

4.1 泰山磐石散可通過(guò)升高外周血E2、P含量早期妊娠婦女外周血較高水平E2能使子宮血流量增加，子宮生長(zhǎng)，盆腔韌帶松弛，P在胎盤中的合成增多。而P能使子宮內(nèi)膜發(fā)生并維持蛻膜化，刺激子宮內(nèi)膜產(chǎn)生并分泌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，供養(yǎng)合子及胚囊，控制子宮收縮力，促進(jìn)母體免疫耐受胎兒，維持妊娠［13］。本課題研究發(fā)現(xiàn)：泰山磐石散干預(yù)后可使流產(chǎn)模型大鼠外周血中E2和P含量升高，其中E2含量顯著升高，此與華凱等［14-15］對(duì)婦女早期妊娠的研究相一致，說(shuō)明外周血E2和P是維持妊娠所必需的，E2和P低表達(dá)是導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)病因素之一。Danielian P J等［16］研究發(fā)現(xiàn)在婦女早期妊娠外周血中低水平P可能導(dǎo)致隨后的SA風(fēng)險(xiǎn)，外周血高水平P可避免SA的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)模型大鼠外周血P含量出現(xiàn)下降現(xiàn)象。泰山磐石散干預(yù)后可提高流產(chǎn)模型大鼠外周血E2和P含量，進(jìn)而維持妊娠，治療SA。

表3 3組蛻膜組織母胎界面平均光密度比較（x±s）

圖3 3組蛻膜組織母胎界面ERα的表達(dá)分布比較（×100）

4.2 泰山磐石散可通過(guò)調(diào)節(jié)蛻膜組織母胎界面ERα的表達(dá)與分布情況 有研究［17-19］證實(shí)E2含量的升高可增加子宮內(nèi)膜ER的表達(dá)，并指出ER合成非常依賴E2的作用。Kelly等［20］發(fā)現(xiàn)并指出由于組織中ER含量降低且導(dǎo)致子宮內(nèi)膜對(duì)激素的反應(yīng)性降低且發(fā)育不良，進(jìn)而使子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的容受性降低，進(jìn)而導(dǎo)致流產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在該模型大鼠中ERα在蛻膜組織胞質(zhì)胞核中的表達(dá)明顯降低，且ERα主要表達(dá)在蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞核，同時(shí)外周血雌激素升高后ERα的表達(dá)也明顯升高。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)大鼠孕早期母胎界面ERα表達(dá)情況：胚胎側(cè)明顯多于子宮側(cè)；溴隱亭造模后可使母胎界面ERα表達(dá)下降，且胚胎側(cè)下降程度明顯高于子宮側(cè)；泰山磐石散干預(yù)后可使母胎界面ERα表達(dá)明顯增多，接近于正常水平，且胚胎側(cè)升高更為明顯。說(shuō)明ERα在胚胎側(cè)高表達(dá)是早期維持妊娠所必需的，母胎界面ERα表達(dá)下降尤其是胚胎側(cè)表達(dá)下降是導(dǎo)致流產(chǎn)的原因之一，泰山磐石散干預(yù)后可明顯改善母胎界面ERα的表達(dá)。因此我們推測(cè)泰山磐石散可通過(guò)升高外周血E2水平進(jìn)而使P表達(dá)增多進(jìn)而使維持蛻膜化，刺激子宮內(nèi)膜產(chǎn)生并分泌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，供養(yǎng)合子及胚囊，控制子宮收縮力，促進(jìn)母體免疫耐受胎兒；同時(shí)外周血中升高的E2刺激母胎界面尤其是胚胎側(cè)ERα的高表達(dá)，使母胎界面尤其是胚胎側(cè)對(duì)激素的反應(yīng)性升高，進(jìn)而使子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的容受性改變，維持妊娠，治療SA。

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