八寶丹抑制胃癌細胞轉移的作用研究

劉建鑫 ，尚海霞 ，楊 弘 ，魏麗慧 ，2，彭 軍 ，2，莊群川 ，2，林久茂 ，2?

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內，每年約有100萬新診斷患者和約74萬胃癌患者死亡［1］。大多數胃癌患者在首診時已是晚期階段同時還伴有遠端轉移或局部浸潤［2］。事實上，大部分癌癥患者不是因為原位癌而死亡，而是轉移癌。轉移是惡性腫瘤的典型特征之一，顯著增加了癌癥相關死亡率［3］。在晚期胃癌患者治療中，放化療仍然是首選方法，常見化療藥物包括奧沙利鉑、5-FU、司莫司汀等［4］。雖然還有越來越多的新藥被研發出來并逐步推廣，但胃癌患者的5 a生存率卻不容樂觀，只有 23%～32%［5］，因此，治療胃癌需要更加有效的藥物。

八寶丹源自1555年宮廷秘方，至今已有460余年歷史，組方包括麝香、羚羊角、牛黃、蛇膽、三七、珍珠6味名貴中藥材［6］，具有清利濕熱、活血解毒、去黃止痛的功效，兼有輔助抗菌、調節機體免疫功能作用，長期服用可以減輕化療藥物的毒副作用，除肝膽疾病、泌尿系統疾病外，在惡性腫瘤、自身免疫性疾病以及其他疑難雜癥的治療方面也取得了良好的效果［6］。但是八寶丹對胃癌細胞的抑制作用及其分子機制尚不明確，因此，本文通過探討八寶丹對胃癌細胞遷移能力的影響，為八寶丹的臨床應用提供進一步的實驗依據。

1 材料

1.1 藥物和細胞株 八寶丹購自廈門中藥廠股份有限公司（0.3 g／粒；生產批號：150930）；人胃癌細胞株AGS和MGC803購自中科院上海細胞生物研究所，保存于福建中醫藥大學醫學實驗中心液氮中。

1.2 試劑與耗材 RPMI 1640培養基、胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素、鏈霉素）、0.25%胰蛋白酶（Trypsin）、二甲亞砜（DMSO）購自美國 Gibco 公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）干粉（北京索萊寶科技有限公司公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone公司。

1.3 儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；CO2培養箱、-80℃冰箱（美國 Thermo公司）；倒置顯微鏡系統（德國Leica公司）；Countes?全自動細胞計數儀（美國 Life公司）；全自動酶標儀（奧地利TECAN公司）。

2 方 法

2.1 BBD溶液制備 將八寶丹粉末，用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成 25 mg／mL的溶液，超聲溶解后高壓滅菌，于4℃貯存備用。

2.2 細胞培養 將胃癌細胞株AGS、MGC803置于含 10%滅活胎牛血清（FBS）、100 U／mL青霉素和100 μg／mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養基中，置于37℃含5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養，分成對照組（0 mg／mL）、低劑量組（0.25 mg／mL）、中劑量組（0.5mg／mL）、高劑量組（0.75 mg／mL），各組給予相應劑量的BBD干預24 h。

2.3 MTT檢測分析 取對數生長期的AGS和MGC803以0.8×105個／mL接于96孔培養板中，每孔 100 μL，置 37℃含 5%CO2培養箱中培養；當細胞匯合度達到50%～60%，吸棄培養液，每孔加入含不同濃度 BBD（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）培養液100 μL；培養 24 h 后每孔加入 MTT（0.5 mg／mL）100 μL繼續培養4 h；然后吸棄液體并加入DMSO 100 μL／孔，室溫放置 10 min，于全自動酶標儀 570 nm測定各組吸光度值（A值），并計算：

細胞生長抑制率／%＝（1－實驗組A值／對照組A值）×100%。

2.4 劃痕實驗分析 取對數生長期的AGS和MGC803細胞以2×105個／mL密度接種于6孔板，置于37℃細胞培養箱中培養過夜，細胞匯合度達到80%～90%時，進行劃痕，并于不同時間點（0、6、12、24 h）進行拍照（×100）。不同濃度藥物干預24 h后，以細胞劃痕的愈合程度來判斷BBD對腫瘤細胞遷移能力的影響。

2.5 Transwell實驗 取對數生長期的AGS和MGC 803以2×105個／mL接種于6孔板中，每孔2 mL，置37℃含5%CO2培養箱中培養；當細胞匯合度達到50%～60%，吸棄孔內溶液，分別加含有不同濃度 BBD（終濃度分別為 0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）的培養基，每孔2 mL；干預24 h后，吸棄各孔溶液，各孔分別進行消化，用不含胎牛血清的培養基重懸細胞；按5×104個／孔接種于Tranwell的上室（內室），下室于實驗前2 h加0.7 mL含10%胎牛血清的培養基（置于37℃含5%CO2培養箱中）；12 h后用棉簽擦去Tranwell內室上層的細胞，其下層用結晶紫染色15 min，最后在倒置顯微鏡拍照（×100）。

2.6 粘附實驗分析 取對數生長期的AGS和MGC803以2×105個／mL接種于6孔板中，每孔2 mL，置37℃含5%CO2培養箱中培養；當細胞匯合度達到50%～60%，吸棄孔內溶液，分別加含有不同濃度 BBD（終濃度分別為 0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）的培養基，每孔2 mL；干預24 h后，吸棄各孔溶液，各孔分別進行消化，重懸，調整細胞密度為2×104個／mL，重新接種于6孔板中；培養 4 h后，吸棄各孔溶液，用PBS洗兩遍，用0.1%結晶紫染色15 min，最后在倒置顯微鏡下拍照（×200）。

2.7 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行處理。計量資料符合正態分布以（x±s）表示，采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。

3 結 果

3.1 BBD對AGS和MGC803細胞活力的抑制率與對照組比較，BBD具有抑制AGS和MGC803細胞活力的作用，并呈劑量依賴性。見表1。

表1 BBD對AGS和MGC803細胞活動的抑制率（x±s）%

3.2 BBD對AGS和MGC803細胞損傷修復能力的影響 劃痕結果顯示：給藥24 h后，對照組劃痕距離明顯縮短，而不同濃度BBD干預后能抑制劃痕距離的縮短，即抑制細胞劃痕愈合程度，并呈劑量依賴性。見圖1、圖2。

圖1 BBD對AGS細胞損傷修復能力的影響（×100）

3.3 BBD對AGS和MGC803細胞遷移能力的影響 Transwell實驗結果顯示：在藥物干預24 h后，對照組有較多的細胞穿過小孔膜，而不同濃度BBD干預后穿過小孔的細胞數量逐漸減少，呈劑量依賴性。見圖3。

3.4 BBD對AGS和MGC803細胞粘附能力的影響 與對照組比較，不同濃度BBD干預后細胞的數目逐漸較少，并呈劑量依賴性。見圖4。

4 討 論

圖3 BBD對MGC803細胞損傷修復能力的影響（×100）

圖4 BBD對AGS和MGC803細胞遷移能力的影響（×100）

圖5 BBD對AGS和MGC803細胞粘附能力的影響（×200）

目前胃癌仍以手術治療為主，輔以化療、放療、生物治療和中醫藥治療等綜合治療［4，5］。但相關研究表明：局部進展期胃癌術后發病率為40%～70%，2次術后的5 a生存率不足25%［7］，很多復發患者伴有遠端轉移和局部浸潤，轉移顯著增加了癌癥相關死亡率［2-3］。因此，尋找更加有效防治胃癌復發轉移的治療藥物成為亟待解決的重要問題。現代醫學治療胃癌等惡性腫瘤的局限性使得臨床療效確切、毒副作用少的中藥復方日益受到國內外研究者的重視。

八寶丹對包括胃癌在內的多種腫瘤具有明顯的療效，與放化療聯合使用可以起到減輕病人疼痛、改善臨床癥狀、降低放化療的毒副作用，延長患者生存期［8］。另外，基礎研究表明八寶丹具有輔助抗菌、抗炎和調節機體免疫功能等作用［6］。但八寶丹對胃癌遷移和侵襲方面的藥效作用及其作用機制尚不清楚。

在腫瘤轉移的過程中，腫瘤細胞的生長活力、遷移能力、粘附能力等起了至關重要的作用。因此，本文觀察八寶丹對腫瘤轉移關鍵環節的影響，來研究八寶丹抑制胃癌細胞轉移的作用。研究結果發現BBD能抑制AGS和MGC803細胞的活力，抑制細胞的損傷修復能力，抑制細胞的遷移能力，抑制細胞的粘附能力，并呈現明顯的劑量依賴作用，提示BBD具有抑制胃癌細胞轉移的作用。本研究為BBD臨床治療胃癌及防治胃癌細胞轉移提供新的實驗依據。

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