柴歡寧神顆粒對肝郁失眠證候大鼠模型行為學及下丘腦—垂體—腎上腺軸的影響

獨家能 聶春霞 許雯雯 劉聰 康永 倪艷 郝旭亮

[摘要] 目的 探討柴歡寧神顆粒對多因素復合法致肝郁失眠證候模型大鼠的行為學和下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的影響。 方法 將70只SD大鼠雌雄各半，隨機分為空白組，模型組，柴歡寧神顆粒高、中、低劑量組（2.25、1.125、0.5625 g/kg），解郁安神組（1.25 g/kg），艾司唑侖組（0.5 mg/kg）。除空白組外，其余各組均采用束縛+夾尾刺激+PCPA多因素制備肝郁失眠證候的大鼠模型。各給藥組經灌胃給予相應的藥物，空白組及模型組給予等體積的生理鹽水，每日1次，連續14 d。分別于實驗第0、7、14、21天測試各組大鼠的體重、糖水消耗量、睡眠狀況及水迷宮定位航行和空間搜索能力等指標評價大鼠的行為學。后采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測大鼠下丘腦中促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）、血漿促腎上腺皮質激素（ACTH）和血清皮質醇（CORT）水平。 結果 與空白組比較，模型組大鼠體重、糖水消耗量、睡眠時間、空間搜索能力明顯降低，下丘腦CRH、血漿ACTH、血清CORT及水迷宮定位航行時間升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。經給藥干預后，與模型組比較，各給藥組可增加大鼠的體重、睡眠時間、糖水消耗量、穿越平臺的次數，同時降低大鼠下丘腦CRH、血漿ACTH、血清CORT的水平，以及定位航行的時間，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 柴歡寧神顆粒可明顯改善肝郁失眠證候模型大鼠的行為學，延長睡眠時間，其機制可能與調節改善HPA軸功能的亢進有關。

[關鍵詞] 柴歡寧神顆粒；肝郁失眠；下丘腦-垂體-腎上腺軸；作用機制

[中圖分類號] R256.23 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（b）-0013-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of Chaihuan Ningshen Granules on the behavior and hypothalamic-pituitary-adrenal （HPA） axis of rats with insomnia with syndrome of stagnation of liver qi induced by multifactor combination therapy. Methods Seventy SD rats （half male and half female） were randomly divided into 7 groups： blank group， model group， high， medium and low dose of Chaihuan Ningshen Granules groups （2.25， 1.125， 0.5625 g/kg）， Jieyu Anshen Granules group （1.25 g/kg）， Estazolam group （0.5 mg/kg）. Except for the blank group， rats in each group were established for the model with syndrome of stagnation of liver qi by multifactorial stimulation including tie， pinch-tail and PCPA. Each administration group was treated daily with an oral infusion of corresponding drug， whereas， the blank group and the model group were given equal volume of saline once a day for 14 days. All rats were tested on the 0， 7th， 14th， 21st d for body weight， sugar consumption， sleep status， water maze navigation and spatial search ability to evaluate the behavior of rats， The levels of corticotropin-releasing hormone （CRH）， adrenocorticotropic hormone （ACTH） and serum cortisol （CORT） in the hypothalamus of rats were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Compared with blank group， the body weight， sugar consumption， sleep duration and spatial search ability of the model group were significantly decreased， while the hypothalamic CRH， plasma ACTH， serum CORT and water maze positioning sailing time were markedly increased （P < 0.05）. Compared with the model group， all medicine groups could significantly increase body weight， sleep duration， consumption of sugar water and the number of crossing platform （P < 0.05）， meanwhile decrease the levels of the hypothalamic CRH， plasma ACTH and serum CORT， as well as water maze positioning sailing time， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Chaihuan Ningshen Granules can remarkably improve the behavior of rats with insomnia with syndrome of stagnation of liver qi， and prolong their sleep time， the mechanism underlying this event is mainly dependent on the improvement effect of Chaihuan Ningshen Granules on the function of HPA axis.

[Key words] Chaihuan Ningshen Granules； Insomnia with syndrome of stagnation of liver qi； Hypothalamic-pituitary-adrenal axis； Mechanism

失眠是臨床上最為常見的一種生理、心理疾病，指入睡困難或睡眠質量差，給人們的正常工作和生活帶來嚴重的不良影響[1-2]。其中，在失眠患者中，肝郁引起的失眠所占比重較大[3]。柴歡寧神顆粒是山西省中醫院調節改善肝郁失眠的常用制劑，組方由柴胡、黃芩、黨參、大黃等14味藥構成，具有調和陰陽、宣暢化郁、重鎮安神之功，多年的臨床應用對于肝郁失眠有一定的療效，但目前對其治療的具體作用機制尚不明確。因此本研究采用多因素復合法制備肝郁失眠的模型，進一步觀察柴歡寧神顆粒對模型大鼠行為學，及對血漿促腎上腺皮質激素（ACTH）、血清皮質醇（CORT）和下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）的影響，從而探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級6周齡SD大鼠雌雄各半，體重（200±20）g，購自中國食品藥品檢定研究院，合格證號SCXK（京）2014-0013。大鼠飼養于山西省中醫藥研究院中藥方劑研究所藥理動物室，每籠5～6只，飼養溫度21～24℃，相對濕度18%～22%，12/12明暗交替，期間自由攝食、飲水，以普通飼料喂養。

1.2 藥物與試劑

柴歡寧神顆粒（山西千匯藥業有限公司，批號：20170801）；解郁安神顆粒（河南輔仁堂制藥有限公司，批號：20161202）；艾司唑侖（山東信誼制藥有限公司，批號：170407）；對氯苯丙氨酸（PCPA）（美國SIGMA-ALDRICH公司，批號：SHBG8045V）；CRH試劑盒（上海優仟生物科技有限公司，批號：2017110）；ACTH試劑盒（上海優仟生物科技有限公司，批號：20171101）；CORT試劑盒（上海優仟生物科技有限公司，批號：20171020）。

PCPA的溶解：將PCPA充分研磨，加入生理鹽水，后滴加幾滴吐溫80助溶，繼續研磨，直至達到基本混溶，臨用時配成40 mg/mL混懸液。

1.3 實驗儀器

KDC-2046低速冷凍離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）；Morris水迷宮視頻跟蹤系統（成都泰盟科技有限公司）；IXA-T25數顯高速離心機；Lenovo電腦；攝像頭；OFT-100開場實驗視頻分析系統（成都泰盟科技有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組與給藥 實驗當日，依據OFT-100開場實驗對大鼠行為學測試的結果，選取活動次數相近的SD大鼠，依照體重隨機分為空白組，模型組，柴歡寧神顆粒高、中、低劑量組，解郁安神組，艾司唑侖組，每組10只。空白組與模型組每天灌胃給予等體積量的生理鹽水。柴歡寧神顆粒高、中、低劑量組（2.25、1.125、0.5625 g/kg），解郁安神組（1.25 g/kg），艾司唑侖組（0.5 mg/kg），以上各組均按大鼠1 mL/100 g配置成相同的水溶液，灌胃給藥。于刺激第7天后，造模的同時開始灌胃給藥，每日1次，連續14 d[4]。

1.4.2 模型制備 參照文獻[5-6]的方法，并加以改進，進行肝郁失眠模型的建立。適應性喂養結束后，分組每籠5～6只飼養，空白組大鼠無任何外加刺激，其他組分別用醫用膠帶將其前肢束縛，使其活動受限，并堅持每天用尖端包裹海綿的止血鉗夾大鼠尾部（離近端1/3處），每只5 min，令其處于打斗狀態，以不破皮流血為度，連續21 d，并在造模第14天后，注射40 mg/mL的PCPA，連續2 d。根據肝郁失眠證候文獻建立本研究造模成功的標準[7]：①實驗動物體重下降，飲食活動量明顯減少。②體毛凌亂無華，精神萎靡，以圈縮為主。③睡眠節律紊亂，時長下降。④再次刺激時，反抗明顯下降，低落。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠一般狀態及總睡眠量 從實驗開始，分別記錄實驗第0、7、14、21天各組大鼠一般狀態的特征，包括精神狀態、活動、毛發、飲食及排泄等指標，并通過監控攝像系統記錄觀察各組大鼠的睡眠時間。

1.5.2 糖水實驗 實驗第0、6、13、20天分別禁水不禁食24 h，次日給予1%的蔗糖水，分別測試大鼠5 h糖水消耗量。

1.5.3 Morris水迷宮實驗 實驗中水深約30 cm，水溫控制在24℃左右，將各組大鼠面壁從固定的位置放入水中（第二象限標記處），儀器追蹤錄像系統自動追蹤記錄大鼠潛伏期（大鼠完全爬上平臺并停留2 s），如果大鼠在2 min內未找到平臺，將其引至平臺[8]。從造模第14天開始訓練，1次/d，連續5 d，選取最后2 d的成績平均值為最終的定位航行成績。第6天撤去水中的平臺，記錄大鼠2 min中內穿越原平臺的次數，分別作為評價大鼠成績的指標[9]。

1.5.4 大鼠下丘腦CRH、血漿ACTH、血清CORT含量檢測 各行為學實驗考察結束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，一部分放入抗凝管中，一部分置于EP管中，后迅速斷頭，置于冰袋上取出下丘腦等腦組織，放置液氮罐中，最后存放于-80℃冰箱中備用；將血清、血漿靜置30 min后，4℃，3000 r/min離心（離心半徑為16 cm），取上清液，于-20℃存放，照試劑盒說明，分別進行下丘腦CRH、血漿ACTH、血清CORT的檢測。

1.6 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件對原始數據進行統計分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用One-way ANOVA單因素方差分析，兩兩組間比較，方差齊則采用LSD法，方差不齊采用Dunnett-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組間大鼠宏觀體表特征及睡眠量

實驗前各組大鼠毛色光亮、活動靈敏，精神狀態良好，睡眠正常；實驗刺激第7天時，除空白組外，其余各組大鼠毛色明顯灰暗，行動遲緩，大多弓背貼壁行走，叫聲變尖細，組內打斗明顯，胡須下垂，大多表現為聚積奢睡，且大便開始不成形；14 d時，模型組大鼠毛發明顯凌亂，夾尾刺激反抗低落，大便溏薄稀，大多弓縮在角落，體重與空白組比較明顯下降（P < 0.05），與給藥組比較差異也有統計學意義（P < 0.05）（圖1）；21 d時，模型組大鼠精神明顯萎靡，全部弓縮在角落，體重與給藥組比較差異均有統計學意義（P < 0.05）（圖1），且通過攝像記錄系統觀察到模型組大鼠睡眠節律紊亂，總睡眠量明顯減少，與空白組比較差異有高度統計學意義（P < 0.01），而給藥組狀態明顯好轉，毛色有光澤，睡眠時間較模型組明顯延長，與模型組比較差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）（圖2）。實驗過程中模型組大鼠死亡1只（可能注射PCPA導致）。

2.2 對肝郁失眠模型大鼠糖水偏愛度的影響

在大鼠接受7、14、21 d刺激后，與空白組比較，模型組大鼠糖水的偏愛度明顯下降（P < 0.05或P < 0.01）；實驗第21天時，與模型組比較，各給藥組大鼠對糖水的偏愛度均明顯增加（P < 0.05），尤以艾司唑侖組明顯（P < 0.01）。見表1。

2.3 對肝郁失眠模型大鼠水迷宮定位航行及空間搜索的影響

與空白組比較，模型組大鼠定位航行時間明顯延長（P < 0.01），穿臺次數顯著減少（P < 0.05）；與模型組比較，各給藥組均較明顯縮短了其定位航行的時間，且增加了穿越平臺的次數，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.4 對肝郁失眠模型大鼠下丘腦CRH、血漿ACTH、血清CORT的影響

與空白組比較，模型組下丘腦CRH、血漿ACTH、血清CORT的含量均明顯升高（P < 0.05或P < 0.01）。與模型組比較，各給藥組均對上述指標有明顯改善（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

3 討論

隨著社會、生活等各方面壓力的增加，肝郁化火、肝郁氣滯已成為引起失眠的主要病機，大多表現為心煩怒燥、胸悶脹痛、舌紅、苔黃等[10]。柴歡寧神顆粒以柴胡、黃芩、大黃為君藥，配伍黨參等14味藥組方，能調陰陽、散肝郁、安心神，故為治療肝郁化火兼有痰熱的良方，并被臨床廣泛應用所證明。本研究采用大鼠束縛+夾尾刺激+PCPA的多因素復合法制備大鼠肝郁失眠證候的動物模型，并從實驗藥效學的角度對其進行了科學論證。

目前研究已表明[11-12]：長期慢性的束縛與夾尾刺激可使大鼠出現諸如胡須下垂、弓背貼壁行走、飲食減少、叫聲尖細等情緒低落的表征。這種表現基本符合情感不舒，郁怒藏抑于體內，肝氣郁滯，而導致的“肝郁”證候。而中醫理論中“肝主藏血”，肝郁久而化熱，耗費陰血而致血不養心，進而神魂不寧、虛煩不眠。 因此本研究在“肝郁”的基礎上，進一步腹腔注射PCPA，耗竭大鼠體內5-HT，大鼠出現明顯晝夜節律紊亂、躁動不安、晝夜不寐的現象，從而科學模擬肝郁失眠的大鼠模型[13]。目前已有眾多的文獻表明，采用此種方法可以較好地建立肝郁失眠的大鼠模型[14-15]。在對大鼠施加3周的刺激進行造模后，分析大鼠的體重、糖水消耗、水迷宮學習記憶能力等行為活動為測試指標。本研究結果顯示，與空白組對比，模型組各項指標均顯著降低（P < 0.05），說明動物模型的建立可信、可靠。臨床肝郁失眠患者情緒低落，晝夜不寐，次日精神萎靡，漸之身體消瘦，影響正常工作生活。這與模型動物體重、糖水的喜好度、記憶力下降、睡眠節律紊亂、總睡眠量減少等特征表現相類似。因此對于柴歡寧神顆粒治療肝郁失眠大鼠模型的研究，可以較好地明確其療效和初步的作用機制，并且通過陽性藥物解郁安神顆粒和艾司唑侖的正向對比，可以更加充分地表明其確切的作用效果，增加實驗的嚴謹性、科學性。

現代研究表明，HPA軸系統與睡眠-覺醒規律之間存在著密切的聯系，HPA軸功能紊亂，睡眠-覺醒規律失常，最終導致失眠的發生[16-17]。HPA軸作為機體最重要的應激反應軸，其中對睡眠的調節起著舉足輕重的作用[18-19]。長期的刺激會導致反應中樞HPA軸的功能亢進，激活腦部的杏仁核組織，增加CRH的分泌與釋放，起到增加覺醒和減少睡眠的作用[20-21]。實驗結果顯示，模型組大鼠下丘腦CRH、血漿ACTH和血清CORT均明顯升高，推測肝郁證候造成的失眠與上述指標紊亂有密切關系。這可能是HPA軸過度活化，持續促使刺激CRH和CORT分泌，使機體處于持續興奮狀態而導致失眠。

本研究從宏觀和微觀兩種角度對模型組與柴歡寧神顆粒組及解郁安神組、艾司唑侖組進行了評價研究。在宏觀上，通過對大鼠毛色、體重、糖水消耗以及睡眠狀況的攝像系統觀察，研究結果提示，柴歡寧神顆粒可以顯著改善模型大鼠的行為學及睡眠的時間；在微觀上，對下丘腦CRH、血漿ACTH和血清CORT等HPA 軸相關指標進行了全面的檢測，結果顯示，模型組上述指標均顯著升高，同時給藥組可以逆轉上述指標的升高，最終結果與模型組比較有顯著差異，提示柴歡寧神顆粒對模型大鼠的作用效果顯著。

綜上所述，柴歡寧神顆粒能夠明顯改善肝郁失眠模型大鼠行為學，并明顯增加大鼠體重，延長睡眠的時間，其作用機制與改善HPA軸功能激進有一定的關系，但具體的作用過程還有待深入探討。

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