實時熒光定量PCR技術快速檢測甲型H1N1流感病毒

谷宇佳

[摘要] 目的 對疑似甲型H1N1流感病毒攜帶者的標本進行病毒核酸確診，進而探討實時熒光定量PCR技術在甲型H1N1流感病毒檢測診斷中的意義。方法 選取2017年9—12月某院檢驗科工作人員采集的330份疑似甲型H1N1流感病毒攜帶者咽拭子標本，對其進行病毒核酸確診檢測，根據檢測結果對甲型H1N1流感病毒、甲1型流感病毒、甲3型流感病毒以及乙型流感病毒進行臨床分型。結果 該組標本中檢出甲型H1N1流感病毒核酸陽性標本108份，檢出率為108/330（32.73%），檢出甲1型流感病毒10份（3.03%），檢出甲3型流感病毒21份（6.36%），未檢出乙型流感病毒。結論 臨床上診斷甲型H1N1流感病毒時，采用實時熒光定量PCR技術，此種技術操作簡單、快速、有著較強的特異性和較高的靈敏度。有著較高的應用價值。

[關鍵詞] 實時熒光定量PCR技術；檢測；甲型H1N1流感病毒

[中圖分類號] R446.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-5654（2018）11（a）-0035-02

甲型H1N1流感病毒是一種甲型流感病毒，臨床上對其進行檢測時，傳統的方法是以細胞培養或者雞胚培養分離定型流感病毒，但是這些方法都需要耗費較長的時間，尤其滿足不了暴發疫情時，對病毒的診斷需求。近些年，隨著醫療技術的發展，實時熒光定量PCR技術被廣泛的應用在了檢測甲型H1N1流感病毒的臨床上，此種技術操作起來極其簡單快捷，并且其靈敏度和自動化的程度比較高，加上對核酸有著較高的擴增性，能夠對甲型H1N1流感病毒做出快速的檢測[1]。為了對實時熒光定量PCR技術在甲型H1N1流感病毒檢測診斷中的意義進行更加深入的探討，2017年9—12月該文選取了330份疑似甲型H1N1流感病毒攜帶者咽拭子標本，對其進行病毒核酸確診檢測后，根據檢測結果對標本進行了臨床分型。現對詳細內容做如下報道。

1 資料與方法

1.1 標本的采集和處理

選取某院檢驗科工作人員采集的330份疑似甲型H1N1流感病毒攜帶者咽拭子標本，其中包括某院兒科門診、內科門診、以及呼吸科病房中發熱伴咳嗽、咽痛等疑似甲型H1N1流感病毒攜帶者的咽拭子標本。該次研究中涉及到的標本的采集、存儲、運輸等各項操作均以《甲型H1N1流感病毒實驗室檢測技術方案（試行）》文件為依據進行執行，將采集到的標準送至實驗室進行檢測，檢測人員要在規定的時間內完成檢測，對于來不及檢測的標本，應將其放置在-70℃的環境下進行凍存。

1.2 儀器與試劑

該次研究中用到的儀器為Ⅱ級生物安全柜（生產企業：美國NuAire NU公司；型號：425-400E）；冷凍離心機（生產企業：美國貝克曼Microfuge公司；型號：22R）；全自動實時熒光定量PCR儀（生產企業：美國ABI公司；型號7500 fast）；旋渦振蕩器（生產企業：德國Heidolph公司）；核酸提取盒【生產企業：德國QIAGEN公司；型號：RNeasy Mini Kit】；無核酸離心管；甲型H1N1流感病毒（2009）RNA檢測試劑盒（生產企業：北京金豪公司）。

1.3 對標本中的病毒進行提取

采用核酸提取盒對標本中的病毒RNA進行提取，提取操作嚴格按照試劑盒中的使用說明書進行。

1.4 反應的體系以及條件

采用甲型H1N1流感病毒（2009）RNA檢測試劑盒。反應體系包括：SWH1反應液、逆轉錄酶，注意所有反應體系的配置情況均以試劑的說明書為依據進行。反應條件：逆轉錄以變性為，在50℃下進行30 min，然后在95℃下進行3 min，按照次順序進行1個循環，預擴增為在95℃下進行15 s，然后在50℃下進行30 s，在72℃下進行1 min，按照此順序進行5個循環，再在95℃下進行10 s，在55℃下進行40 s，按照此順序進行40個循環，最后為熒光收集，選取FAM信道在55℃的環境下進行單點熒光檢測。

2 結果

2.1 RT-PCR技術的特異性與敏感性

采用實時熒光定量PCR技術對甲1型流感病毒、甲3型流感病毒以及乙型流感病毒的RNA樣本進行檢測，這樣也能夠排除甲型H1N1流感病毒的可能性。對本院檢驗科人員所提取的甲型H1N1流感病毒RNA的檢測過程中，特異性引物和探針對檢測結果起到了輔助性的作用。

2.2 對疑似流感標本的檢測結果

該組標本中檢出甲型H1N1流感病毒核酸陽性標本108份，檢出率為108/330（32.73%），檢出甲1型流感病毒10份（3.03%），檢出甲3型流感病毒21份（6.36%），未檢出乙型流感病毒。詳見表1。

對該次檢測結果進行分析后發現，甲型H1N1流感病毒陽性率逐漸降低，疫情基本處于穩定狀態，并且越進入冬季，所檢測出來的流感樣病理基本都是甲型H1N1流感病毒。

3 討論

定量實時PCR技術是美國Applied Biosystems公司在1996年研發出來的一種新技術，此種技術不但能夠解決PCR污染的問題，還具有較高的自動化程度以及較強的特異性[2]。采用此種技術對甲型H1N1流感病毒進行檢測診斷時，由于將實時PCR技術與逆轉錄技術結合了起來，因此被叫做定量“RT-PCR”技術。結合起來的這種技術能夠用少量的RNA識別出在某個特定時間、細胞以組織內的特定基因，將此種技術應用在檢測甲型H1N1流感病毒檢測診斷的臨床上，為提高診斷準確性提供了可靠的依據[3]。

根據國家對甲型H1N1流感病毒檢測診斷的標準以及處理原則，對流行性感冒病原學常規的檢測方法為病毒培養法，這種方法雖然也有著較高的診斷準確率，但是確診時間一般在15～20 d，并且還會受到實驗室條件和人員條件的限制。而定量實時PCR技術檢測法不但靈敏度高，操作方便，最主要的是耗時短，整個檢測過程只需要3～4 h就可以完成，尤其在甲型H1N1流感病毒爆發的季節，此種方法是最為有效的檢測手段[4]。

實時熒光定量PCR技術是通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測來實現了對起始模板定量以及定性的分析，在這個擴增反應中，將熒光化學物質引入其中，熒光強度的信號會隨著擴增反應的進行而逐漸加強，此時所監測到的信號就可以繪制成一條曲線，然后對未知模板進行定量分析。在實際檢測的過程中，既有特異性引物存在，還有核苷酸探針存在，其目的都是在進行擴增反應時，利用聚合酶的活性將探針進行水解，使其水解成單核苷酸，此時有力的熒光報告基因導致的熒光信號的增加，就會通過熒光信號強度進行的實時動態進行檢測，從而達到對擴增反應產物進行定量的分析[5]。

該次研究中，選取了2017年9—12月某院檢驗科工作人員采集的330份疑似甲型H1N1流感病毒攜帶者咽拭子標本，采用定量實時PCR技術對其進行病毒核酸確診檢測后結果顯示，該組標本中檢出甲型H1N1流感病毒核酸陽性標本108份，檢出率為108/330（32.73%），檢出甲1型流感病毒10份（3.03%），檢出甲3型流感病毒21份（6.36%），未檢出乙型流感病毒。并且在進入11月份和12月份后，甲型H1N1流感病毒的檢出率逐漸降低。在9月份開始，各學校已經開學，這種聚集性的環境非常有利于甲型H1N1流感病毒的傳播和擴散，進入11月后，氣溫逐漸轉變涼，甲型H1N1流感病毒的陽性率逐漸下降，這可能是由于進入冬季后，人們的個人預防意識增強，加上甲型H1N1流感病毒疫苗的廣泛注射，陽性率有所降低。

綜上所述，臨床上診斷甲型H1N1流感病毒時，采用實時熒光定量PCR技術，此種技術操作簡單、快速、有著較強的特異性和較高的靈敏度，建議將此種檢測技術應用在更多的臨床上。

[參考文獻]

[1] 紀衍瑾，孫雯雯，朱喆.定量實時PCR技術快速檢測甲型H1N1流感病毒[J].中國民康醫學，2015，27（17）：61-62.

[2] 方盛藩，鄭夔，李小波，等.甲型H1N1流感病毒實時熒光定量PCR標準陽性模板的構建[J].中國衛生檢驗雜志，2015， 25（1）：1-3.

[3] 尹航，楊煥良，陳艷，等.甲型H1N1流感病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J].中國預防獸醫學報，2013，35（1）：36-39.

[4] 陳棋炯，孫永祥，丁水軍，等.應用實時熒光定量PCR技術快速檢測甲型H1N1流感病毒[J].中國衛生檢驗雜志，2010，20（6）：1394-1396.

[5] 尹惠瓊，劉松婷，史利軍，等.甲型H1N1流感病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測技術[J].生物技術通訊，2010，21（2）：244-247.

（收稿日期：2018-08-01）