傳統(tǒng)海洋中藥淡菜高效液相（HPLC）指紋圖譜研究

龔曾豪 于春光 金艷霞 王燕 王斌

[摘要]指紋圖譜技術(shù)在傳統(tǒng)中藥材及其制劑的質(zhì)量控制中應(yīng)用較多，在種類鑒別和質(zhì)量優(yōu)劣判斷方面具有重要作用。但是，指紋圖譜技術(shù)在傳統(tǒng)海洋中藥領(lǐng)域應(yīng)用較少。基于此，采用高效液相色譜法（HPLC），建立淡菜的HPLC指紋圖譜，并根據(jù)峰面積和保留時間標定了其中的13個共有峰。利用來自全國不同產(chǎn)區(qū)的24批供試品樣本驗證建立淡菜HPLC指紋圖譜的有效性，試驗結(jié)果證明利用10批供試品所建的HPLC指紋圖譜可以快速地區(qū)分不同種類的淡菜，聯(lián)合聚類分析，可對淡菜溯源提供技術(shù)支持。因此，淡菜高效液相（HPLC）指紋圖譜可為其物種鑒別和溯源提供技術(shù)支持，對其有效成分的分離和鑒別提供了科學(xué)依據(jù)，也為其他傳統(tǒng)海洋中藥的質(zhì)量控制提供借鑒。

[關(guān)鍵詞]指紋圖譜；淡菜；高效液相色譜；聚類分析

[中圖分類號]R284 [文獻標識碼]A

傳統(tǒng)中藥材的產(chǎn)地來源與其品質(zhì)和質(zhì)量安全息息相關(guān)，建立健全的中藥材質(zhì)量評價和溯源體系對保證中藥材質(zhì)量安全至關(guān)重要。我國中藥材的質(zhì)量控制分為兩個方面，依靠定性鑒別（性狀鑒別和顯微鑒別技術(shù)）確定樣品的真?zhèn)?，該方法需要鑒定者長期工作于第一線接觸實物，具備較強的實踐經(jīng)驗；而以化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及其性質(zhì)的理化鑒別評價中藥材的優(yōu)劣，重點監(jiān)測藥材復(fù)雜成分中的少數(shù)特定的“有效成分”，但是因為檢測的對象少，容易忽視不同化學(xué)成分之間的協(xié)同作用。目前，以化學(xué)成分為基礎(chǔ)的指紋圖譜技術(shù)廣受關(guān)注，被確認為傳統(tǒng)中藥材品種鑒定、質(zhì)量控制和產(chǎn)地溯源的關(guān)鍵技術(shù)，而以指紋圖譜作為控制傳統(tǒng)中藥材品質(zhì)的方法得到國際社會認可。目前，色譜技術(shù)（如高效液相色譜（HPLC）和波層色譜）、光譜技術(shù)（如紅外光譜和核磁共振）逐漸多樣化，且應(yīng)用日益普遍，且各種儀器的性能和精密度和檢測能力日益增強，為指紋圖譜研究和應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。高效液相（HPLC）指紋圖譜法不但可用特征峰做定性鑒別，還可以根據(jù)各峰的相對峰面積進行定量分析，是目前中藥化學(xué)成分指紋圖譜的主流方法。

淡菜為貽貝科動物肉的干制品，具有補肝腎，消癭瘤，益精血之功效，袁高峰等試驗證明其脂溶性成分具有較好的抗炎效果。我國從南至北各海域均產(chǎn)有貽貝，是世界上貽貝產(chǎn)量最高的國家，品種主要有翡翠貽貝（Perna viridis）、紫貽貝（Mytilus edulis）和厚殼貽貝（Mytilus coruscus），但是產(chǎn)地和品種不同致使貽貝質(zhì)量參差不齊，加工成淡菜后品質(zhì)不一。所以，利用指紋圖譜技術(shù)建立淡菜的質(zhì)量評價和產(chǎn)地溯源技術(shù)對其產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義重大?；诖耍緦嶒炓試鴥?nèi)不同區(qū)域的24批淡菜供試品為研究對象，利用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)建立淡菜HPLC指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析鑒別淡菜的產(chǎn)地。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗試劑與材料

色譜純乙腈和甲醇分別購于美國Fisher公司和Burdick & Jackson公司；無水乙醇、甲醇均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，24批傳統(tǒng)藥食兩用海洋中藥淡菜供試品分別購于全國主要的貽貝產(chǎn)地，詳細信息見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液的制備。參照孟志娟試驗方法，以無水乙醇為提取溶劑采用超聲提取法制備淡菜醇提物。具體操作流程如下：淡菜干燥、粉碎過40目篩，按照1 g/100 mL比例稱取0.7 g加入到盛有無水乙醇的圓底燒瓶中，密塞并稱重，用超聲波提取器在300 W功率下超聲提取30 min后，補足損失無水乙醇，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除提取物中的乙醇，然后加入色譜純甲醇，利用超聲溶解提取物，最后定容至5mL，微孔濾膜（0.45?m）除去溶液中的不溶性雜質(zhì)，得供試品溶液。

1.2.2 HPLC實驗條件。色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18 （4.6 × 250 mm， 5μm）；檢測波長：210 nm；參比波長：360 nm；Agilent柱溫箱G1316A溫度：30 ℃；流速：1.0 mL/min；供試品自動進樣器G1313A進樣量：20 ?L；流動相：色譜純乙腈（A）-0.1%色譜純磷酸水（B）梯度洗脫，梯度程序如表2所示。

2 結(jié)果

2.1 海洋中藥淡菜參考指紋圖譜的建立

根據(jù)1.2.1的方法制備S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8、S9、S11和S12等10批淡菜供試品的溶液，按照試驗方法1.2.2所描述的HPLC色譜條件分別將10批淡菜供試品的溶液加入到HPLC中，獲得相關(guān)色譜數(shù)據(jù)，以AIA格式將所得到的供試品HPLC圖譜數(shù)據(jù)（保留時間和峰面積等）依次導(dǎo)入國家藥典委員會推薦的數(shù)據(jù)處理軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版），對相關(guān)數(shù)據(jù)進行比對和分析，以淡菜供試品S1（大連夏方水產(chǎn)有限公司）的HPLC色譜圖為參照譜圖進行指紋匹配，建立S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8、S9、S11和S12等10批淡菜供試品的對照指紋圖譜共有模式，結(jié)果如圖1中的R色譜圖所示。根據(jù)對照指紋圖譜共有模式中各個色譜峰的峰面積及穩(wěn)定性，確定其中的13個峰為共有峰（見圖2），共有峰面積之和占總峰面積的90%以上，符合高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的標準。

基于峰面積和相對保留時間的相似度分析是建立傳統(tǒng)中藥材供試參考指紋圖譜的主要途徑，也是樣品間比較分析的報告重要依據(jù)。因此，本實驗根據(jù)10批淡菜供試品（S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8、S9、S11、S12）的HPLC圖譜的峰面積和相對保留時間信息，利用國家藥典委員會推薦的數(shù)據(jù)處理軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版），計算與對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果如由表3所示。供試品S2的HPLC圖譜與對照指紋圖譜的相似度最高，而供試品S6的HPLC圖譜與對照指紋圖譜的相似度最低。因此，確定供試品S2的圖譜作為淡菜的HPLC參考指紋圖譜（見圖2）。

2.2 高效液相色譜（HPLC）特征峰的確定及淡菜供試品真?zhèn)舞b別

特征峰是代表檢測樣品特征屬性的化學(xué)成分在色譜圖上的體現(xiàn)，具有特定保留時間，并且與其他化學(xué)成分的峰面積具有相對固定的比值。由圖1和圖2相關(guān)信息表明，色譜峰P4、P6、P8、P9和P10的分離度比較好，特征明顯，可以代表本實驗所檢測的淡菜樣品的指紋特征。因此，選擇5個主要共有峰（P4、P6、P8、P9和P10）為淡菜指紋圖譜的特征峰。其中特征峰P6的峰面積較大，與其他色譜峰比較具有明顯優(yōu)勢，而且其出峰時間處于高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的中間，易于和其它峰進行比較分析，確定其為色譜圖的參照峰。

利用HPLC建立的中藥材的指紋圖譜，特別是其中的特征信息（特征峰的相對保留時間參數(shù)）可以專一的體現(xiàn)所檢測中藥材的特性。因此，利用指紋圖譜進行中藥材的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣鑒別是其建立的重要目的。因此，將淡菜高效液相色譜（HPLC）參考指紋圖譜參照峰（P6號峰）的相對保留時間（RRT）定為1，計算試驗所檢測的10批淡菜供試品指紋圖譜剩余4個特征峰的相對保留時間（RRT），結(jié)果見表4。取剩余未進行分析的14批淡菜供試品進行分析，其色譜圖見圖3。與圖2比較分析表明：淡菜高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的5個特征峰均存在于剩余的采集于全國主要產(chǎn)區(qū)的14批淡菜供試品；與前10批樣品的特征峰的相對保留時間（RRT）平均值進行比較，結(jié)果表明剩余的采集于全國主要產(chǎn)區(qū)的14批淡菜供試品各特征峰相對保留時間（RRT）與之吻合度良好，證明剩余的采集于全國主要產(chǎn)區(qū)的14批供試品均非偽品。

2.3 淡菜供試品的產(chǎn)地鑒別

以淡菜供試品指紋圖譜中6號峰為參照峰，相對峰面積定為1，計算24批淡菜供試品指紋圖譜13個共有峰的相對峰面積，并以13個共有峰的相對峰面積為指標，將24批不同產(chǎn)地的淡菜供試品的共有峰相對峰面積導(dǎo)入SPSS19.0進行聚類分析，結(jié)果見圖4。

圖4中橫坐標代表采集于全國主要產(chǎn)區(qū)的24批淡菜供試品之間的距離，縱坐標代表全國主要產(chǎn)區(qū)的24批淡菜供試品的編號。由圖4可知，除供試品S7（煙臺龍潤食品有限公司）、S10（青島福興祥物流股份有限公司）、S21（煙臺、散裝）外，相同產(chǎn)地的淡菜供試品均聚集為相同的類群。該研究結(jié)果也表明產(chǎn)地不同導(dǎo)致淡菜供試品在化學(xué)組成上存在一定差異，而HPLC指紋圖譜輔以聚類分析能較好地反映出供試品與產(chǎn)地之間的關(guān)系。

3 結(jié)論

本文以10批傳統(tǒng)藥食兩用海洋中藥淡菜為供試品，建立淡菜的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，指紋圖譜中包含了13個共有峰。應(yīng)用國家藥典委員會推薦的數(shù)據(jù)處理軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）進行相似度計算，結(jié)果表明10批傳統(tǒng)藥食兩用海洋中藥淡菜樣本指紋圖譜具有良好的相似度，達到了建立中藥材高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜要求。在此基礎(chǔ)上，對24批供試品進行了聚類分析（clustering analysis），結(jié)果表明采集于全國主要產(chǎn)區(qū)的24批淡菜供試品基本能根據(jù)樣品來源聚集成同一類群。因此，HPLC指紋圖譜能夠較好的對淡菜進行品種和產(chǎn)地鑒別，為海洋中藥質(zhì)量標準的建立及溯源技術(shù)研究提供了技術(shù)支持。

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