青藤堿結腸給藥微球的設計及體外釋放研究

田 亮 ，徐珊珊 ，薛 潔 ，朱麗敏 ，胡 歡

（1.上海德濟醫院·青島大學第九臨床醫學院，上海 200331； 2.上海市浦東新區浦南醫院，上海 200125）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一組病因不明的慢性免疫性疾病，其發病機制可能為感染、飲食等環境因素作用于遺傳易感人群，使腸免疫反應過度亢進導致腸黏膜受損[1]。目前的傳統治療方法療效不佳，且生物治療價格又昂貴。青藤堿（sinomenine，SN）是從防己科植物青風藤及毛青藤的藤莖中提取的生物堿單體，臨床常采用其鹽酸鹽形式來治療多種免疫相關類疾病，如風濕、類風濕關節炎及紅斑狼瘡等，療效顯著[2]。研究發現，SN可抑制小鼠腸道黏膜促炎性因子的分泌、顯著改善結腸的病理狀態，具有抗炎、抗潰瘍及免疫調節作用[3-4]。但鹽酸青藤堿的半衰期短、生物利用度較低，有胃腸道刺激[5]，臨床療效不佳。結腸釋藥系統（colon specific drug delivery systems，CDDS）的優點是可避免口服藥物在上消化道被破壞和釋放，將藥物直接輸送到結腸，再以速釋（脈沖）或緩釋、控釋方式給藥，發揮局部或全身療效。本研究中采用乳化交聯法制備青藤堿殼聚糖微球，再用液中干燥法在微球表面包裹丙烯酸樹脂，使用正交試驗設計優選條件，以制備特異性高的結腸釋藥系統應用于IBD的治療。

1 材料與儀器

1.1 材料

鹽酸青藤堿（西安森弗制藥有限公司，批號201007，含量＞98%）；青藤堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110774，含量99%）；殼聚糖（濟南海得貝海洋生物工程有限公司，脫乙酰度90.6%）；丙烯酸樹脂Ⅱ、Ⅲ（上海浦力膜制劑輔料有限公司）；丙酮、乙醚、冰醋酸、乙酸乙酯、span 80、無水乙醇等均為分析純，戊二醛飽和甲苯溶液自行配置。

1.2 儀器

LD-101021型冷凍干燥機（德國 Christ公司）；RHbasic-1型磁力攪拌儀（德國IKA公司）；S-3000N型掃描電鏡，U-0080D型紫外分光光度儀（日本日立公司）；光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Shimadzu 200型電子分析天平（日本島津公司）。

2 方法與結果

2.1 青藤堿殼聚糖微球的制備

采用乳化交聯法制備殼聚糖微球。取一定量的殼聚糖，逐量加入3%醋酸溶液中，40℃水浴加熱至溶解，靜置除去氣泡后備用。精密稱取鹽酸青藤堿適量，溶于適量水中至完全溶解，再與殼聚糖溶液混合均勻作為水相。將青藤堿殼聚糖溶液緩慢勻速逐滴滴加到5%span 80的液狀石蠟油相中，以不同速度攪拌，乳化1 h后，逐滴加入戊二醛飽和甲苯溶液，30 min后再次加入戊二醛進一步交聯固化30 min，之后停止攪拌，以2 000 r/min的速率離心5 min使微球沉降。傾倒上清液，沉淀微球分別用乙醚、乙酸乙酯清洗數次，丙酮揮干。精確稱量所得微球質量，放入冷凍干燥機中干燥備用。

2.2 青藤堿殼聚糖微球的包衣

適量稱取丙烯酸樹脂Ⅱ、丙烯酸樹脂Ⅲ（1∶1，W/W）溶于 10 mL 丙酮與甲醇（1∶1，V/V）的混合溶液中，混勻備用。稱取上述制備好的含藥殼聚糖微球按核∶衣＝1∶1或1∶2加入到該溶液中，混合均勻。將此混合液逐滴加入到含5%span80的100 mL液狀石蠟中，1000 r/min、40℃攪拌4 h，直至丙酮、甲醇揮發干，停止攪拌，清洗、干燥同上，并稱量微球質量。

2.3 粒徑測量與表面形態分析

使用目鏡含有標尺的光學顯微鏡分別測量青藤堿殼聚糖微球及包衣微球，隨機測量其中100個微球的粒徑，取平均值。使用掃描電鏡觀察微球表面形態，碳帶固定，加速電壓20 kV，并照相。

2.4 青藤堿檢測波長選擇和標準曲線繪制

稱取適量干燥的青藤堿對照品，置50 mL容量瓶中，加乙醇溶解，然后用水稀釋至刻度，搖勻，制成1 mL含青藤堿0.1 mg的溶液。按照2015年版《中國藥典（四部）》通則 0401“紫外 -可見光分光光度法”[6]，在200～400 nm波長范圍內掃描。結果表明，鹽酸青藤堿的最大吸收波長為265 nm。精密稱取干燥至恒重的青藤堿對照品25.0 mg，置50 mL容量瓶中，加適量乙醇溶解并以水稀釋至刻度，搖勻，精密量取 0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL，分別置 50 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，按照紫外分光光度法，在265 nm波長處測定吸光度(A)，以吸光度對質量濃度(C)進行線性回歸，得標準曲線方程 A＝0.012 5 C+0.018 4，r＝0.999 9(n＝6)。同法繪制以人工胃液（pH ＝1.2）、胃腸混合液（pH ＝4.5）、人工腸液（pH ＝ 6.8）、人工大腸液（pH ＝ 7.4）、PBS液為介質的標準曲線。結果表明，青藤堿質量濃度在5～80 μg/mL范圍內與各種介質中吸光度均呈良好線性關系。

2.5 微球包封率與載藥量測定

精密稱取 20 mg含藥微球，加入 50 mL PBS液（pH ＝7.4），37℃下在搖床上以 100 r/min的速率操作48 h，后超聲 2 min，樣品以 1 000 r/min的速率離心，取上清液過濾。精密量取濾液5 mL置50 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度。采用紫外分光光度法在265 nm波長處測量吸光度，依據標準曲線算出青藤堿的質量濃度，并計算微球的載藥量和包封率。含腸衣微球可將其外層腸衣先用甲醇洗盡，再測其包封率。載藥量（LE，%）＝微球中青藤堿的質量 /微球的質量 ×100%，包封率（ER，%）＝微球中青藤堿的質量/所投青藤堿的質量×100%。

2.6 正交試驗設計法優化制備工藝

根據試驗和文獻[6]，選取對微球性質影響最顯著的4個因素為考察對象，即殼聚糖質量濃度(因素A)、水油體積比(因素B)、交聯劑用量(因素C)、攪拌速率(因素D)，每個因素設3個水平（見表1）。

表1 正交試驗因素水平表

對相關因素及水平采用最佳工藝重復制備2批微球，取其包封率、載藥量及粒徑分布百分比的平均值為指標，采用 L9(34)正交試驗設計優選最佳制備工藝條件，并用Z評分綜合評價法[7]，對多指標進行歸一化處理，評價試驗結果。計算公式：為指標值，為指標均值，si為標準差。∑Zi＝∑Z高優-∑Z低優。試驗因素水平見表1，正交設計結果見表2。可見，各因素對微球性質影響的大小順序為C＞A＞B＞D。得出最優化的試驗方案為A2B2C1D2。即微球制備最佳工藝為殼聚糖質量濃度15 g/L，水相∶油相體積比為1 ∶10，交聯劑 3 mL，攪拌速率為 600 r/min。

表 2 L9（34）正交試驗結果

優化工藝驗證：采用最佳工藝重復制備6批微球，在干燥狀態下呈棕黃色粉末，溶于無水乙醇，在光學顯微鏡下觀察，微球呈淡黃色，表面光滑，球體均勻，流動性好，粘連少。掃描電鏡下微球表面含有少量的藥物結晶，詳見圖 1。測定微球包封率為（59.00 ± 13.26）% ，載藥量 為 （16.10 ±4.51）% ，20 ～100 μm 粒 徑 分 布 為（33.58 ±1.83）% ，平均粒徑為（15.61 ± 7.50）μm。結果顯示，優化工藝制備穩定，重復性好。

2.7 腸衣微球評價

采用腸衣丙烯酸樹脂包裹優化制備青藤堿殼聚糖微球，通過光學顯微鏡和掃描電鏡可以觀察到，包裹前后微球粒徑明顯增加5～10 μm，微球呈不規則球狀（圖1），粒徑、包封率見表3。

2.8 微球體外釋放

圖1 光鏡與掃描電鏡下青藤堿殼聚糖微球形態

表3 含腸衣微球的粒徑和包封率（n＝3）

試驗根據模擬胃腸液動態的pH變化來測試接近生理狀態下微球的體外釋放度。將微球精密稱量后放入透析袋中，按釋放度測定法[2015年版《中國藥典（四部）》通則0931“溶出度與釋放度測定法”]操作，注入同樣遞質的溶液2 mL，扎緊袋口。置98 mL溶劑中，按如下時間點進行。遞質 A：人工胃液（pH ＝1.2），時間 1 h；遞質 B：腸胃混合液（pH ＝4.5），時間 2 h；遞質 C：人工腸液（pH ＝6.8），時間 2 h；遞質 D：人工大腸液（pH ＝7.4），時間大于2 h。將遞質4換為含3%大鼠結腸內容物來測定其模擬結腸的釋放度，其他遞質和時間點同上，100 r/min，（37.0 ± 1.0）℃ 動態透析，在設定時間取樣，同時補加相同量的稀釋液。樣品過濾稀釋后在265 nm波長處測定其吸光度，根據標準曲線推算質量濃度，計算微球累積釋放百分數。

圖2 37℃青藤堿微球及其腸衣微球在不同pH遞質中的釋放

圖3 不同核/衣比例腸衣微球在有無大鼠結腸內容物的人工腸液中（pH ＝7.4）的釋放

結果見圖2和圖3。可知，未包衣的青藤堿殼聚糖微球在前 5 h內（pH ＝1.2～6.8）釋放了將近 80%的藥物。包腸衣微球在模擬胃液中穩定無藥物釋放，直到pH＞6時才開始緩慢釋放。數據顯示，前3 h 2種不同比例衣材均未釋放，進入pH＝6.8腸液中核衣比為 1∶1和1∶2的微球釋藥的釋放度分別為（8.91 ± 0.39）% 和（6.73 ±0.25）% ，而在 pH＝7.4 的腸液中 24 h 后能達到（59.52 ±1.23）% 和 （57.11 ±1.13）% 。 若 5 h 后 將pH＝7.4腸液置換成含大鼠結腸內容物腸液，結果表明，24 h未含內容物藥物釋放度分別為（72.54±1.33）% 和（70.31 ± 1.36）% 。

3 討論

目前，已開發的結腸釋藥系統中時滯型胃排空差，定位效果差，工藝復雜；pH依賴型所用腸衣材料一般在pH介于6～7時溶解，因此可能提前釋藥，且腸道pH易受食物和疾病影響，個體差異大[8]。殼聚糖是由甲殼素經脫乙酰化反應轉變成相對分子質量為12萬～59萬的生物大分子，具有良好的生物相容性和生物降解性，可在結腸被特異性酶降解，同時其生物黏附性可使其黏附于黏膜表面，從而延長藥物作用時間，故將其常用于結腸釋藥系統的載體[9]。Dubey等[10]用殼聚糖制成微球后采用腸溶聚合物包衣制成結腸靶向制劑，發現9 h后所載藥物在結腸濃度最高，并且減少了藥物在消化道的吸收和帶來不良反應，具有結腸靶向釋藥作用。本試驗中采取殼聚糖裝載青藤堿，外層包裹丙烯酸樹脂腸衣，制備了pH依賴型和酶促型相結合的口服結腸定位微球，利用丙烯酸樹脂在胃中不溶，在偏中性的大腸液中可溶解的特點，將其包裹殼聚糖微球，避免殼聚糖受到強酸而溶脹的影響。使微球不受消化道介質的影響而在結腸被特定的菌群和酶降解，從而達到將裝載于微球中的藥物在結腸部位釋放。并采用正交設計來篩選殼聚糖微球優化條件，用醛交聯法制備的微球電鏡觀察結果顯示，成球性好，形態圓整，粘連少，包封度達60%，且易制備。

結腸釋藥系統不但要保護所載藥物在通過胃和小腸時不被破壞，而且要使藥物在結腸釋放，判斷是否實現了結腸定位，是評價的關鍵。傳統的體外溶出試驗，由于不能模擬動態的胃腸道pH變化和結腸中大量細菌及內容酶存在的生理環境，而不能準確地預測體內行為。Chourasia等[11]的研究指出，以一定的pH時間變化梯度及加入嚙齒類動物盲腸內容物的改良法，可彌補傳統方法的不足。結果顯示，釋放試驗中未包腸衣青藤堿殼聚糖微球，在最初的4 h突釋了73% ～80%，這并不符合藥物結腸靶向的目的。而包裹丙烯酸樹脂的微球，在pH＞6.8才開始釋藥，可顯著阻止青藤堿在腸上段釋放。使用液中干燥法制備的含腸衣殼聚糖微球，根據核/衣質量比的不同平均粒徑可為19～25 μm，主要歸因于多聚物濃度增加導致較大的乳化液滴，從而降低了藥物的釋放。本試驗中將5 h之后的溶液換成pH＝7.4含有3%（W/V）大鼠結腸內容物來測量微球釋放。當上述溶液中藥物的釋放度顯著提高時，腸衣微球12 h釋放50%以上，可推斷結腸中含有的一些特異性酶加速了殼聚糖的生物降解。

本試驗中采用乳化醛交聯法制備的青藤堿殼聚糖微球，經丙烯酸樹脂腸衣包裹后能特異性地在結腸部位釋放青藤堿，以初步探究中藥結腸靶向藥物在治療IBD中應用的可能性，改善中藥在吸收和定位方面的問題，但其治療價值還需進一步通過動物試驗和人體生物利用度的評價來證實。

參考文獻：

[1] Abraham C，Cho JH.Inflammatory bowel disease[J].N Engl J Med，2009，361（21）：2066-2078.

[2] 黃小魯，王 勇，郝 飛.青藤堿對機體免疫系統的影響及臨床應用進展[J].醫藥導報，2007，26（4）：397-399.

[3] 周國勝，吳正祥，楊九華，等.青藤堿對結腸炎大鼠基質金屬蛋白激酶的作用 [J].世界華人消化雜志，2008，16（30）：3387-3393.

[4] Cheng H，Xia B，Guo Q，et al.Sinomenine attenuates 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in mice[J].Int Immunopharmacol，2007，7（5）：604-611.

[5] 陳萬一，周遠大，康紀平，等.青藤堿在Beagle犬體內的藥動學和絕對生物利用度研究[J].中國中藥雜志，2009，34（4）：468-471.

[6] Kriznar B，Mateovic T，Bogataj M，et al.The influence of chitosan on in vitro properties of Eudragit RS microspheres[J].Chem Pharm Bull（Tokyo），2003，51（4）：359-364.

[7] 趙應征，魯翠濤，梅興國.常用多指標綜合評價法在優選實驗中的應用[J].醫學研究生學報，2004，17（7）：624-626.

[8] 于小華，劉曉華，趙浩如.口服結腸靶向給藥系統的研究概況[J].海峽藥學，2009，21（7）：19-21.

[9] Kosaraju SL.Colon targeted delivery systems：review of polysaccharides for encapsulation and delivery[J].Crit Rev Food Sci Nutr，2005，45（4）：251-258.

[10] Dubey R，Dubey R，Omrey P，et al.Development and characterization of colon specific drug delivery system bearing 5-ASA and Camylofinedihydrochlorideforthetreatmentofulcerativecolitis[J].J Drug Target，2010，18（8）：589-601.

[11] Chourasia MK，Jain SK.Design and development of multiparticulate system for targeted drug delivery to colon[J].Drug Deliv，2004，11（3）：201-207.