環孢素A預處理對離體大鼠心肌細胞凋亡及心臟乳酸脫氫酶和Na+，K+-ATP酶活性的影響

陳 璐，趙 鑫

（1.蘇州大學附屬第二醫院麻醉科，江蘇 蘇州 215004； 2.內蒙古自治區腫瘤醫院麻醉科，內蒙古 呼和浩特 010020）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心病）的發病率及死亡率均呈逐漸升高趨勢，未來有可能超過癌癥等成為對我國人群危害最大的疾病[1-2]。1960年，詹寧斯首次提出了心肌缺血-再灌注損傷的概念，心肌的持續性缺血會導致心肌組織出現不可逆損傷與細胞死亡，早期再灌注治療雖可減輕心肌缺血的損傷程度，但治療后會引起更嚴重的損傷，表現為心律失常、心肌梗死面積增大、持續性心室收縮功能降低等，病理變化表現為心肌細胞水腫，心肌細胞膜與細胞器被破壞，心肌纖維出現破壞性斷裂及微血管損傷等[3-4]。目前，對于心肌再灌注損傷的處理方法包括缺血后處理、缺血預處理等，但均為各類保護機制共同作用的結果，至今仍未找到有較強針對性的處理藥物，也未找到相應的藥物靶點[5]。研究顯示，環孢素A除有免疫抑制作用外，還有其他的生物學效應，可用于預防心肌缺血-再灌注損傷[6]。為了探討環孢素A對心肌缺血-再灌注的影響，本研究中選擇離體大鼠心臟模型，并就環孢素A對乳酸脫氫酶活性，心肌細胞凋亡與Na+，K+-ATP酶活性的影響進行探討。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

選擇健康雄性 Wistar大鼠 48只，月齡 5～12個月，體質量300～350 g，購自蘇州大學醫學部試驗動物科學部，動物等級為普通級，許可證號為SCXK2002-0001。

1.1.2 試藥與儀器

主要試劑的生產廠家和批號見表1。Krebs灌注液由 NaCl，KCl，KH2PO4，CaCl2，NaHCO3與葡萄糖配制而成，配制完成后用0.45 μm濾膜濾過，灌注前向其中持續注入 95% 氧氣（O2）與 5% 二氧化碳（CO2）。Langendorff離體心臟灌注裝置，由心臟保溫室、恒溫加熱管、恒溫水浴箱與恒流泵組成，利用恒溫水流保證灌注液與心臟保溫室溫度保持在（37±0.5）℃。

表1 主要試劑生產廠家與批號

1.2 方法

所有大鼠均先用乙醚吸入麻醉，麻醉完成后將大鼠取仰臥位，四肢伸展后固定。沿著右側腹股溝將大鼠的皮膚剪開，于股靜脈注射肝素鈉，劑量為3 U/g。沿著大鼠的肋緣下方將腹壁橫向剪開，再沿胸骨的左緣將肋骨剪斷，打開大鼠胸腔，充分暴露心臟。在主動脈根部上方1 cm處剪斷血管，快速取出心臟，放置在配置好的Krebs液中。然后將主動脈接到Langendorff離體灌注裝置的主動脈插管上，并進行結扎固定。打開主動脈夾，對心臟進行逆行恒壓灌注，保持灌注壓在10 kPa，觀察心臟自主搏動情況。Krebs液氧分壓保持在70～73 kPa，二氧化碳分壓保持在 4.8 ～5.8 kPa，pH 保持在 7.35 ～7.45。用恒溫水浴維持整個灌流系統與心臟溫度在36.8～37.5℃。

按隨機數字表法將大鼠分為對照組（A組），缺血再灌注組（B組）和環孢素A組（C組），各16只。A組大鼠利用 Krebs液進行全心灌流 90 min；B組大鼠先用Krebs液進行灌注，使心臟保持在正常工作狀態30 min，然后切換成缺血狀態30 min，之后再灌注30 min。C組大鼠首先利用Krebs液進行灌注10 min，然后換成濃度為0.1 mmol/L環孢素A的K-B液進行灌注，心臟在持續給藥狀態下保持正常工作20 min，然后切換成缺血狀態30 min，之后再灌注30 min。

1.3 觀察指標

乳酸脫氫酶活性：收集3組大鼠心臟再灌注冠狀動脈流出液體，利用紫外分光光度法測定其乳酸脫氫酶活性。乳酸脫氫酶活性（U /g）＝ [Δ A340×反應體系體積（μL）]/[吸光系數 ×心肌質量（g）×10-3]。采用島津UV-2450型紫外/可見分光光度計進行檢測，試劑盒購自南京建成生物有限公司。

心肌梗死面積百分比：從每組隨機選擇8只大鼠的心臟，從灌注液中取出，用生理鹽水進行沖洗后，將心房、血管與脂肪組織等剪除，在-20℃下保存10 min，然后將心室肌制成厚度為1 mm的薄片，立刻放入2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）磷酸鹽緩沖液中，在37℃下避光染色30 min，用超純水對心肌切片清洗3次，放入10%的甲醛溶液中固定12 h。根據顏色的界限，將心肌切片劃分為2個區域，未出現梗死的區域為磚紅色，出現梗死的區域為灰白色。利用數碼相機采集心肌圖片，利用制圖軟件進行分析，計算心肌梗死面積的百分比。心肌梗死面積百分比＝（灰白色面積/心肌片總面積）×100%。

Na+，K+-ATP酶活性：將每組剩余8只大鼠的心臟于灌注完成后從灌流裝置中取出，利用液氮中預先冷卻好的Wollenberger夾板將心肌組織夾成冰凍薄片，在-80℃下冷凍干燥，利用高氯酸萃取，取勻漿液3 000 g，離心后（試劑盒購自南京建成生物有限公司）測定Na+，K+-ATP酶活性。

表2 3組大鼠乳酸脫氫酶與Na+，K+-ATP酶活性比較（s）

表2 3組大鼠乳酸脫氫酶與Na+，K+-ATP酶活性比較（s）

注：與 A 組比較，aP ＜0.05；與 B 組比較，bP ＜0.05；與 C 組比較，cP ＜0.05。

項目乳酸脫氫酶活性（U /g，n＝16）Na+，K+-ATP 酶活性（U /mgprot，n ＝ 8）A組2.68 ± 0.81bc 122.80 ± 6.85bc B組10.66 ± 3.70ac 165.97 ± 12.66ac C組7.50 ± 1.97ab 138.22 ± 6.40ab F值42.533 46.279 P＜ 0.01＜ 0.01

圖1 3組大鼠心肌梗死情況

1.4 統計學處理

采用SPSS 20.0統計學軟件處理。計量資料以s表示，3組及以上計量數據比較采用方差分析，若結果為陽性，則利用 q檢驗進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

結果見表2和圖1。3組大鼠心肌梗死面積百分比分別為 0，（33.11 ±4.01）%，（24.22 ±1.77）%，差異有統計學意義（F ＝366.713，P ＜0.05）；q檢驗結果顯示，任意兩組大鼠間的數據差異均有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

環孢素A是鈣調神經磷酸酶的特異性拮抗劑。目前對于該酶信號傳導通路與心肌肥大、血管平滑肌細胞增殖，內皮細胞功能的作用機制的關系已基本研究清楚，但環孢素A鈣調神經磷酸酶在心肌細胞凋亡過程中的具體作用機制尚有爭論，尚不明確到底是促進細胞凋亡還是抑制細胞凋亡[7-8]。心肌缺血一段時間后，在冠狀動脈出現再通的情況下會加重心肌損傷，即出現心肌缺血-再灌注損傷，繼而導致心肌細胞凋亡，對于患者的心功能恢復非常不利。在心肌出現再灌注時，心肌細胞內會產生過量活性氧，直接損傷細胞壁，增加細胞膜通透性，鈣離子內流，引發鈣離子超載。研究結果顯示，心肌細胞內的鈣離子超載在心肌缺血-再灌注損傷導致的心肌細胞凋亡發病機制中有著重要作用[9-10]。鈣調神經磷酸酶的活化依賴于細胞內鈣離子濃度持續升高及鈣調蛋白的調節作用，故鈣離子超載可以作為鈣調神經磷酸酶活化的重要因素[11]。國外研究表明[12]，將小鼠的鈣調神經磷酸酶抗體基因敲除后，更易出現急性缺血引發的心肌細胞凋亡，從而提出鈣調神經磷酸酶信號途徑可能介導心肌細胞的凋亡。環孢素A可通過抑制鈣調神經磷酸酶的活性來抑制心肌細胞的凋亡，可減輕腦缺血-再灌注后的腦梗死面積，并可抑制缺血-再灌注后的細胞凋亡。環孢素A為線粒體膜的保護劑，可抑制線粒體膜的通透性改變，穩定線粒體的膜性結構，在腦缺血出現再灌注的早期使用環孢素A可以起到較明顯的線粒體保護功能。線粒體通透性的改變為缺血-再灌注后各種損失機制的焦點，也是缺血-再灌注損傷的核心環節之一。有專家推測，線粒體及其通透性的改變有可能成為預防缺血-再灌注損傷的靶點。環孢素A可影響線粒體膜通透性，穩定線粒體膜，減輕線粒體內部鈣離子超載與氧自由基的生成，抑制細胞的凋亡[13-14]。

也有研究認為，能量代謝障礙是心肌缺血-再灌注損傷的起因[15]。缺血發生后，組織中的高能磷酸化合物逐漸減少，在發生組織再灌時，能量底物又被沖洗出來，合成高能磷酸化合物數量不足，這就對以ATP為直接能量的心肌細胞造成嚴重影響。心肌一旦缺血，心肌細胞會迅速從有氧代謝轉化為無氧糖酵解狀態，而在此狀態下，ATP的生產能力僅為有氧代謝情況下的1/18左右，導致心肌細胞內的ATP快速消耗，直接影響依賴ATP工作的細胞膜上的泵。細胞膜泵功能顯著降低，細胞內的鈣離子超載與氧自由基產生，進一步擴大再灌注損傷。缺血-再灌注狀態下，Na+，K+-ATP酶的活性受到沖擊，其應激反應的結果就是從原始狀態被激活，促使能量代謝加速，并調節細胞內各種離子濃度的平衡，分解ATP，降低細胞內的能量儲備。環孢素A可抑制Na+，K+-ATP酶活性，其作用機制：一是能激活體內與體外的蛋白激酶C（PKC），而PKC可抑制細胞膜上Na+，K+-ATP酶的活性；二是可抑制體內血管緊張素Ⅱ與醛固酮，而這2個激素是可以激活泵活性的激素；三是環孢素A屬親脂性物質，易進入細胞膜，可通過該種方式影響膜外側脂類構造，繼而影響膜的流動性[16]。另外，環孢素A可抑制鈣調神經磷酸酶的活性，降低Na+，K+-ATP酶活性，導致后者對于ATP的分解能力降低，其結果就是細胞內部保留的磷酸腺苷水平上升[17]。

乳酸脫氫酶可以催化丙酮酸與NADH生成乳酸與NAD+，在反應過程中 NADH脫氫轉化為 NAD+，而NADH在340 nm波長處有光吸收，在此波長處NAD+無光吸收。所以，通過在340 nm波長（A340）處光吸收的減少情況對乳酸脫氫酶活性進行測定。未出現梗死的心肌細胞，其脫氫酶可以將TTC還原呈現紅色，心肌組織呈現出磚紅色，但梗死的心肌細胞的細胞膜出現破壞，脫氫酶外漏，無法將TTC還原，所以心肌組織呈現灰白色。Na+，K+-ATP酶為P型ATP酶，在生物膜上廣泛分布，ATP酶可以分解ATP，產生ADP與無機磷，故對無機磷的測定可以判定ATP酶的活力。因此，本研究中通過乳酸脫氫酶活性與心肌梗死面積2個指標衡量缺血再灌注心肌損傷程度。結果顯示，環孢素A的使用明顯降低了缺血-再灌注心肌梗死的面積，乳酸脫氫酶活性，以及 Na+，K+-ATP 酶活性（P＜0.05），提示環孢素 A可以延緩心肌缺血造成的損傷，對心肌細胞具有防護作用。

綜上所述，環孢素A預處理可減少缺血-再灌注損傷后心肌細胞乳酸脫氫酶的活性，減少心肌細胞凋亡，降低 Na+，K+-ATP酶的活性，對心肌缺血-再灌注損傷有一定預防和保護作用。

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