再造丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

程似錦，李 恒

（1.長江職業(yè)學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)院，湖北 武漢 430064； 2.武漢藥品醫(yī)療器械檢驗所，湖北 武漢 430075）

再造丸，原方為《圣濟(jì)總錄·牛膝木瓜丸》之化裁方，是由秦艽、續(xù)斷等14味中藥材經(jīng)粉碎后加入蜂蜜以水泛丸制成的純中藥復(fù)方制劑，能祛風(fēng)止痛、除濕舒筋，用于風(fēng)濕痹證引起的關(guān)節(jié)疼痛、肢體麻木、行履不健等癥。方中秦艽具有祛風(fēng)濕、清濕熱之功效[1]，續(xù)斷補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨[2-3]，以固其本。為有效控制該藥品質(zhì)量，本研究中建立了秦艽、續(xù)斷的薄層色譜定性鑒別法以及秦艽中龍膽苦苷的含量測定方法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜儀（包括DAD檢測器、UV檢測器，美國DIONEX公司）；色譜柱，戴安Acclaim 120 C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），Phenomenex Synergi柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），依利特 Hypersil BDS C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；CAMAG TLC VISUALIZER薄層色譜照相儀，BP211D電子天平（賽多利斯公司，感量 0.01 mg /0.1 mg）；硅膠 G 薄層板（青島海洋化工廠）。

1.2 試藥

龍膽苦苷對照品（批號110770-200712，純度以99.1%計），川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（批號 111685-200802），秦艽對照藥材（批號 121199-200702），續(xù)斷對照藥材（批號121033-200608），均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，水為超純水。5批樣品由某制藥有限公司提供（批號分別為B#05S-0809，B#05L-1009A，B#05L-1009B，B#05S-0306，B#05S-0306A）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

秦艽[4-5]：取本品 5 g，研細(xì)，加硅藻土 5 g，加甲醇50 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL，微熱使溶解，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次25 mL，棄去乙酸乙酯液，水液再用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次25 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次25 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取秦艽對照藥材0.25 g，加甲醇20 mL，同法制成對照藥材溶液。再取龍膽苦苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例、制備工藝制備缺秦艽的陰性對照品，按照供試品溶液方法制得。照薄層色譜法[2015年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗，吸取上述4種溶液各3～5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（20 ∶2 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜和對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，分離度良好，陰性樣品（缺秦艽）無干擾。結(jié)果見圖1A。

續(xù)斷[5-6]：取秦艽鑒別項下供試品溶液作為供試品溶液。按處方比例，制備工藝制備缺續(xù)斷的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。另取續(xù)斷對照藥材0.25 g，加甲醇20 mL，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。再取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述4種溶液各3～5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-醋酸-水（4∶1∶5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材和對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的主斑點，分離度良好，陰性樣品（缺續(xù)斷）無干擾。結(jié)果見圖1B。

圖1 薄層色譜圖

2.2 龍膽苦苷含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：戴安 Acclaim 120 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 - 水（30 ∶70）；檢測波長：275 nm；流速：1.0 mL/min；理論板數(shù)按龍膽苦苷峰計算應(yīng)不低于 3 000。柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取龍膽苦苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含15 μg的溶液，即得。供試品溶液：取本品，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL置10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。陰性對照品溶液：按處方比例、制備工藝制備缺秦艽的陰性對照品，按照供試品溶液方法制得。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2.2項下3種溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明，供試品溶液色譜中，在與龍膽苦苷對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰，陰性對照品溶液色譜中無相應(yīng)色譜峰。樣品中其他原輔料未對待測物的檢測產(chǎn)生干擾。對供試品溶液色譜中與龍膽苦苷溶液相同保留時間色譜峰進(jìn)行DAD（190～400 nm）掃描，所得光譜圖與龍膽苦苷對照品相一致。詳見圖2。

線性關(guān)系考察：稱取龍膽苦苷對照品（純度99.1% ）9.96 mg，精密稱定，置 50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取25 mL置50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得到質(zhì)量濃度為0.098 7 g/L的對照品貯備液。再分別精密量取上述對照品貯備液 1，5 mL 置 100 mL 容量瓶中；1.0，1.5，2.0，5.0，10.0 mL置10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為 9.870×10-4g/L，4.935 × 10-3g /L，9.870 × 10-3g /L，1.481 × 10-2g /L，1.974 × 10-2g/L、4.935 ×10-2g/L、9.870 × 10-2g/L的對照品溶液。分別精密吸取上述系列對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝20.796 6 X-0.076 9，r＝ 0.999 9(n＝ 7)。結(jié)果表明，龍膽苦苷進(jìn)樣量在 0.019 74 ～ 1.974 1 μg 范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗：吸取質(zhì)量濃度為 0.014 91 g/L的龍膽苦苷對照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，以對照品峰面積計算精密度。結(jié)果的 RSD為 0.24%（n＝6），表明儀器精密度良好。在不同時間以不同的色譜柱將同批樣品依法制備供試品溶液，測定含量。結(jié)果3次測定平均含量為 1.39 mg/g，RSD ＝0.42%(n＝3)，表明方法中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別在 0，2，4，8，12 h 時進(jìn)樣。結(jié)果平均峰面積值為5.783，RSD ＝0.62%(n＝5)，表明供試品溶液在 12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取本品（批號B#05S-0809）9份（取樣量分別為 0.7，1.0，1.3 g 各 3 份），依法制備供試品溶液，測定。結(jié)果含量平均值為 1.378 mg/g，RSD ＝0.54%(n＝9)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密稱定已知含量的樣品（批號B#05S-0809，含量 1.378mg/g）0.5g，共取 6 份，分別置于具塞錐形瓶中，再精密量取50 mL質(zhì)量濃度為0.014 91 g/L的對照品溶液6份，分別加入上述具塞錐形瓶中，再按照供試品溶液項下方法制備供試品溶液，測定并計算回收率。結(jié)果回收率在 97%～99%內(nèi)，平均 98.11%，RSD＝0.44%(n＝6)，表明方法準(zhǔn)確性較好。

圖2 專屬性試驗色譜圖和光譜圖

2.2.4 樣品含量測定

取5批樣品，依法測定含量。結(jié)果批號為B#05S-0809，B#05L-1009A，B#05L-1009B，B#05S-0306，B#05S-0306A的樣品中，龍膽苦苷含量分別為 1.38，1.34，1.32，0.70，0.73 mg /g。

3 討論

本品為水蜜丸，且加蜜量為30%，在定性鑒別中加適量硅藻土去除煉蜜，用乙酸乙酯去除脂溶性成分，從而有效減少了雜質(zhì)干擾。對秦艽、續(xù)斷薄層色譜進(jìn)行了展開溫度、濕度、不同廠家薄層板的考察，均分離良好，說明此方法可以作為其定性鑒別的方法。

2015 年版《中國藥典（一部）》中“秦艽”“龍膽”含量測定項下[5]，龍膽苦苷檢測波長分別為254 nm和270 nm。按照“2.2.1”項下色譜條件對龍膽苦苷對照品溶液進(jìn)行測定，并做DAD（190～400 nm）掃描，所得光譜圖顯示龍膽苦苷在244，275 nm處有較大吸收，供試品色譜中龍膽苦苷在相應(yīng)波長亦有較大吸收。對供試品溶液、對照品溶液在254 nm及275 nm同時做雙波長檢測，發(fā)現(xiàn)龍膽苦苷峰在275 nm波長所測響應(yīng)值較254 nm高約20%，且供試品溶液色譜中雜質(zhì)峰較少。參考其他文獻(xiàn)資料[7-10]，最終選擇275 nm為龍膽苦苷含量測定的檢測波長。

本研究中對提取方法，提取時間，提取溶劑的體積進(jìn)行了考察[11-12]，結(jié)果加熱回流提取的龍膽苦苷含量較高，表明加熱回流提取效率更高；加熱回流30 min，1 h，2 h時提取的龍膽苦苷含量相當(dāng)；25，50，100 mL提取的龍膽苦苷含量相當(dāng)。故選擇甲醇50 mL加熱回流1 h作為提取方法。

本研究中建立了中藥成方制劑再造丸中秦艽、續(xù)斷的薄層色譜鑒別法，以及秦艽中龍膽苦苷的含量測定方法，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了方法和依據(jù)。

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