遠端缺血預處理及創傷預處理對缺血再灌注損傷心肌的保護作用及抗氧化能力的比較

柴青，張可賢，唐育民，李桂芳

(四川省腫瘤醫院·研究所 麻醉醫學中心/四川省癌癥防治中心，四川 成都 610041)

隨著圍術期醫學的提出，臨床麻醉醫師和外科醫師對合并有各種慢性疾病的老年人的圍術期安全及其臟器功能保護越來越重視[1]。在眾多影響圍術期安全的因素中，組織器官所承受的缺血再灌注損傷是影響病人生存率和死亡率的一個重要因素,1986年Murry等[2]首次提出了缺血預處理(ischemia preconditioning，IPC)的概念，指出一個短暫間斷的缺血再灌注過程能夠誘導機體產生保護機制，從而減輕之后長時間的缺血再灌注損傷。1993年Przyklenk等[3]又提出了遠端缺血預處理(remote ischemia preconditioning)的概念，既通過遠離目標器官部位的短暫缺血來達到保護目標臟器抵御缺血再灌注損傷的目的。2004年Ren等[4]發現了一種新的心肌保護現象，他們觀察到給予腹部切口的小鼠，其心肌缺血再灌注損傷后的心肌梗死面積較對照組明顯減少，他們將這種非缺血預處理現象命名為“遠端創傷預處理”(remote preconditioning of trauma)。在之后的研究中科學家指出，腹部切口通過切口部位的傷害性感受器刺激神經信號的傳導，通過脊神經通路興奮了心臟的交感神經系統，進而促進一些內源性介質的釋放，產生了對心肌的保護作用。雖然物理方法的遠端創傷預處理無法在臨床上實踐,但是辣椒素能夠激活皮膚上的C感覺纖維，產生模擬遠端創傷預處理的心肌保護作用，這也為遠端創傷預處理的臨床應用提供了一條嶄新的道路。

相較于遠端缺血預處理，遠端創傷預處理方面的研究還很少，這兩種截然不同的預處理方法誰的心肌保護作用更強還不得而知，如果兩者聯合應用是否能增強心肌保護作用也不確定。鑒于使用藥物可能因為個體差異及使用劑量的不確定性而難以達到較好的和一致的遠端創傷預處理效果，故本研究采用對大鼠腹部切開的物理方法進行遠端創傷預處理，來比較遠端創傷預處理與遠端缺血預處理的優劣以及聯合運用的效果，進而論證在臨床實際應用中這兩者如何取舍，以便于臨床決策的制定。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及分組

50只雄性7周齡SD大鼠，體重250～300 g，由四川省動物中心提供，給予相同飼料喂養于相同環境下(氣溫23 ℃，濕度60%，12 h的晝夜交替)。用電腦自動生成的隨機數字表將大鼠隨機分為5組，實驗流程見圖1。假手術組，僅開胸；對照組，僅開胸建立心肌缺血再灌注損傷模型；遠端創傷缺血預處理組(創傷缺血組)，腹部正中橫切口開腹2 cm作為創傷刺激，并阻斷雙側股動脈5 min，再灌注5 min，反復3個循環，縫合腹部切口，再建立心肌缺血再灌注損傷模型；遠端創傷預處理組(創傷組)，腹部正中橫切口開腹2 cm,30 min后縫合切口，再建立心肌缺血再灌注損傷模型；遠端缺血預處理組(缺血組)，不開腹，僅阻斷雙側股動脈5 min，再灌注5 min，反復3個循環，再建立心肌缺血再灌注損傷模型。

圖1實驗流程圖

1.2 主要試劑及儀器

大鼠肌鈣蛋白I檢測試劑盒(ELISA)(武漢Uscn生命科學有限公司)，TUNEL染色試劑盒(美國Promega公司)，4,6- 聯脒- 2- 苯基吲哚(DAPI)染料(美國Sigma化學公司)。

小動物呼吸機和生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)，血氣分析儀(美國Radiometer Medical Aps.)，離心機(美國COULTER公司)，酶標儀(美國Bio- Tek儀器公司)，自動生化儀(深圳Mindray公司)，石蠟封片機、切片機、熒光顯微鏡(德國LEICA公司)。

1.3 實驗步驟

(1)大鼠稱重并記錄數據，用保溫毯保持體溫在37 ℃。(2)予2%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔注射麻醉，麻醉滿意后仰臥固定于手術臺上，術中每60 min給予25 mg·kg-1的劑量維持麻醉。(3)氣管切開接呼吸機，設置呼吸參數為：氧濃度40%，呼吸機頻率60～70次·min-1，潮氣量2.5～3.5 ml，吸呼比1∶2。(4)右頸總動脈置管接換能器記錄心率、血壓。標準肢體Ⅱ導聯連接心電圖。(5)按實驗分組在不同部位予以相應預處理措施，再建立心肌缺血再灌注模型(在左心耳下緣冠狀動脈左前降支中點位置以6- 0帶針線縫扎血管，造成心肌缺血30 min，松開縫線給予再灌注180 min)。實驗過程中注意監測、記錄實驗開始前，預處理后，洗脫期后，心肌缺血后，心肌再灌注1、2、3 h時的血壓水平。(6)冠狀動脈結扎成功的判斷標準：ST段改變(ST段抬高或下移，T波高聳或倒置)；心律失常(可見室性心律失常如室性早搏、陣發或非陣發室性心動過速，房室傳導阻滯和室內阻滯等)；結扎遠端局部發白；血壓下降。(7)排除標準：平均動脈壓持續低于60 mmHg且難以回復，或者失血過多實驗結束時血紅蛋白含量低于50 g·L-1。

1.4 標本處理及數據測定

心肌再灌注180 min后經頸動脈置管取血，離心留取上清，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malondialdehyde,MDA)，自動生化儀測定血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase- MB,CK- MB),酶聯免疫吸附法測定肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)。

處死大鼠后取其心臟，將心尖到缺血遠端部位制作石蠟標本，采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated deoxyuridine triphosphate nick- end labeling assay,TUNEL)行熒光染色，正常細胞被染成藍色，凋亡細胞被染成綠色，熒光顯微鏡下觀察，每個標本取5個高倍鏡視野，通過Image J 1.44p軟件計算凋亡指數(apoptotic index,AI)，AI定義為凋亡細胞總數與所有細胞總數之比。

1.5 統計學處理

實驗數據以均數±標準差表示，采用SPSS 17.0統計軟件，組間比較行單因素方差分析，兩兩比較使用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血流動力學指標

實驗過程中各組血壓情況見表1。大鼠基礎血壓組間比較差異無統計學意義。實驗結束時假手術組血壓最高，為(119±26.2)mmHg，對照組血壓最低，為(101±21.8)mmHg，兩組之間差異有統計學意義(P=0.034)；假手術組血壓與各實驗組間比較差異無統計學意義。

表1 大鼠平均動脈血壓 mmHg

a 與假手術組比，P<0.05

2.2 氧化抗氧化指標及心肌損傷標記物指標

各組血清MDA、SOD、LDH、CK- MB、cTnI測值及比較如圖2。假手術組及對照組血清MDA水平分別為(3.5±0.6)nmol·ml-1和(4.8±0.7)nmol·ml-1，差異有統計學意義。創傷缺血組為(3.7±1.0)nmol·ml-1,創傷組為(3.7±0.6)nmol·ml-1，缺血組為(3.6±0.8)nmol·ml-1，3個實驗組與假手術組比較沒有差異，而與對照組比較差異均有統計學意義。假手術組血清SOD水平為(161.1±39.3)U·ml-1，對照組為(117.4±25.8)U·ml-1，兩組比較差異無統計學意義。創傷缺血組為(176.5±65.6)U·ml-1，創傷組為(195.5±65.5)U·ml-1,缺血組為(171.2±31.0)U·ml-1，與假手術組比較差異均無統計學意義，而與對照組比較差異均有統計學意義。血清LDH水平對照組最高，為(911.1±265.5)U·L-1，最低為假手術組的(290.3±65.9)U·L-1，3個實驗組分別為(511.2±89.9)U·L-1、(616.2±182.2) U·L-1和(622.0±112.5)U·L-1，實驗組與對照組和假手術組比較差異均有統計學意義。血清CK- MB水平仍是對照組最高，為(413.0±99.5)U·L-1，假手術組最低，為(180.5±62.5)U·L-1，對照組與創傷缺血組[(246.0±52.7)U·L-1]、創傷組[(218.2±62.8)U·L-1]、缺血組[(186.0±68.3)U·L-1]之間兩兩比較差異有統計學意義。cTnI水平在假手術組最低，為(42.5±6.5)pg·ml-1，對照組最高，為(60.1±12.1)pg·ml-1，兩組差異有統計學意義。3個實驗組分別為：創傷缺血組(44.1±5.9)pg·ml-1、創傷組(43.7±8.3) pg·ml-1、缺血組(42.7±4.7)pg·ml-1，均與假手術組無差異，而與對照組比則均有差異。

a 與假手術組比，P<0.05;b 與對照組比，P<0.05

圖2大鼠血清MDA、SOD、LDH、CK-MB、cTnI箱式圖

2.3 心肌細胞AI

大鼠心肌細胞凋亡染色如圖3，心肌細胞AI統計學分析如圖4。假手術組AI最低，為(5.26±4.99)%，與其他4組比較差異均有統計學意義。對照組AI最高，為(31.75±10.65)%，創傷缺血組為(18.32±9.30)%，與對照組比差異有統計學意義(P=0.016)，創傷組為(18.51±9.26)%，與對照組比差異也有統計學意義(P=0.017)，缺血組為(20.41±3.86)%，與對照組比差異同樣有統計學意義(P=0.038)，但3個實驗組間比較差異無統計學意義。

凋亡細胞染成綠色，正常細胞染成藍色

圖3大鼠心肌細胞TUNEL染色熒光照片×400

3 討 論

遠端缺血和創傷預處理作為兩種比較有前景的預處理方法，我們的研究對其優劣及聯合應用的必要性進行了論證。結果顯示，實驗結束后3個實驗組的氧化抗氧化指標、心肌損傷血清學指標及心肌細胞AI均與對照組有統計學差異，顯示出了預處理措施對心肌的保護作用。而3個實驗組之間兩兩比較則差異無統計學意義，也就是說無論是單獨運用遠端缺血預處理還是單獨運用遠端創傷預處理，或者兩者聯合運用，均能起到保護心肌抵抗缺血再灌注損傷的作用，但是聯合應用兩種預處理方法并不能增強對心肌的保護作用。

我們認為，3種預處理方式的心肌保護效果相當是由于其作用機制的殊途同歸導致的。遠端缺血預處理的作用是通過釋放體液介質或者神經調質或者兩者聯合來發揮的[5]，這些介質包括腺苷、緩激肽、熱休克蛋白、腫瘤壞死因子- α、一氧化氮、阿片類物質等等[6- 8]。而遠端創傷預處理可能主要依靠神經途徑發揮作用，腹部皮膚外周感覺神經的疼痛性刺激能夠通過胸9- 10脊神經激活心臟的感覺神經，使心臟交感神經釋放去甲腎上腺素和緩激肽，進而發揮對心臟的保護作用[9]。但兩者最后通過活性介質在心臟局部引起保護作用的信號轉導途徑是相似的，都能引起蛋白激酶C活化，ATP敏感的線粒體鉀通道開放，抑制細胞凋亡，促進保護因子合成等[6,9- 12]。

a 與假手術組比，P<0.05；b 與對照組比，P<0.05

圖4大鼠心肌細胞AI箱式圖

基于以上結果我們認為，在臨床實踐決策時對于需行腹部大手術的患者可以不必再給予遠端缺血預處理來保護其臟器功能，因為其腹部切口已經相當于對其進行了遠端創傷預處理；而對于行腹部手術以外的其他非心臟手術的患者以及行微創腔鏡手術的患者，遠端創傷預處理是不可行的，此時給予遠端缺血預處理就能發揮一定的臟器保護作用。

[參考文獻]

[1] MILLER T E,SHAW A D,MYTHEM M G,et al.Perioperative Quality Initiative (POQI)Workgroup.Evidence- based perioperative medicine comes of age:the Perioperative Quality Initiative (POQI):the 1st Consensus Conference of the Perioperative Quality Initiative (POQI)[J].Perioper Med,2016,5:26.

[2] MURRY C E,JENNINGS R B,REIMER K A.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986,74(5):1124- 1136.

[3] PRZYKLENK K,BAUER B,OVIZE M,et al.Regional ischemic “preconditioning” protects remote virgin myocardium from subsequent sustained coronary occlusion[J].Circulation,1993,87(3):893- 899.

[4] REN X,WANG Y,JONES W K.TNF- alpha is required for late ischemic preconditioning but not for remote preconditioning of trauma[J].J Surg Res,2004,121(1):120- 129.

[5] LIM S Y,YELLON D M,HAUSENLOY D J.The neural and humoral pathways in remote limb ischemic preconditioning[J].Basic Res Cardiol,2010,105(5):651- 655.

[6] XUAN Y T,GUO Y,ZHU Y,et al.Endothelial nitric oxide synthase plays an obligatory role in the late phase of ischemic preconditioning by activating the protein kinase C epsilon p44/42 mitogen- activated protein kinase pSer- signal transducers and activators of transcription1/3 pathway[J].Circulation,2007,116(5):535- 544.

[7] WONG G T,LING J,IRWIN M G.Activation of central opioid receptors induces cardioprotection against ischemia- reperfusion injury[J].Anesth Analg,2010,111(1):24- 28.

[8] KANORIA S,JALAN R,SEIFALIAN A M,et al.Protocols and mechanisms for remote ischemic preconditioning:a novel method for reducing ischemia reperfusion injury[J].Transplantation,2007,84(4):445- 458.

[9] JONES W K,FAN G C,LIAO S,et al.Peripheral nociception associated with surgical incision elicits remote nonischemic cardioprotection via neurogenic activation of protein kinase C signaling[J].Circulation,2009,120(11Suppl):S1- 9.

[10] SADAT U.Signaling pathways of cardioprotective ischemic preconditioning[J].Int J Surg,2009,7(6):490- 498.

[11] DAS B,SARKAR C.Is preconditioning by oxytocin administration mediated by iNOS and/or mitochondrial K(ATP) channel activation in theinvivoanesthetized rabbit heart?[J].Life Sci,2012,90(19- 20):763- 769.

[12] GROSS G J,BAKER J E,MOORE J,et al.Abdominal surgical incision induces remote preconditioning of trauma (RPCT) via activation of bradykinin receptors (BK2R) and the cytochrome P450 epoxygenase pathway in canine hearts[J].Cardiovasc Drugs Ther,2011,25(6):517- 522.