影響試管群落中耐藥大腸桿菌比例因素的研究

楊 可，呂世明*，譚艾娟，劉金平，寇 宏，王 想，張順然

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2. 貴州大學生命科學學院，貴陽 550025)

抗菌藥的廣泛使用，導致細菌耐藥性水平不斷增加[1]，使動物細菌感染的控制難度加大，養殖風險和成本增高，危害養殖業的健康發展[2]。同時，動物源細菌耐藥性可通過食物、飲水和接觸等方式傳遞給人，危及人的健康[3]。如何控制耐藥病原菌及其危害是擺在人類面前一個重大的公共衛生安全問題[4]。目前能有效降低細菌耐藥性的措施仍舊十分匱乏，歐美一些國家采取優化用藥方案[5]、限用乃至禁用抗菌藥[6]等方法來減低耐藥性，但效果不甚理想[7]。β-內酰胺類是目前人醫和獸醫臨床最常用的一類抗生素[8]。2017年耐β-內酰胺類腸桿菌科細菌被WHO列入首份“用于指導新型抗生素研究和開發的全球抗生素耐藥重點病原體名單”中[9]。尋求如何對抗耐β-內酰胺類抗生素的病原體已成為國際研究的熱點[10]。本研究通過創建耐藥菌-敏感菌，耐藥菌-敏感菌-益生菌等二元和三元微生物群落[11]，考察耐藥菌起始比例、益生菌種類和營養水平對耐氨芐西林大腸桿菌在群落中比例變化的影響，以期為了解耐藥菌生存競爭能力[12]、制定科學合理的降低和消除動物源耐藥性措施提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 豬源耐藥大腸桿菌G414(氨芐西林MIC>512 μg/mL)由貴州大學動物藥理實驗室保藏；大腸桿菌標準菌株ATCC25922(批號A0246B)購自廣東環凱生物科技有限公司；蠟樣芽孢桿菌CICC21252、凝結芽孢桿菌CICC20138、枯草芽孢桿菌CICC20683、地衣芽孢桿菌CICC20684購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.2 藥品 氨芐西林鈉(批號N0521A)購自大連美侖生物技術有限公司；伊紅美藍瓊脂(EMB，批號20160909)、LB肉湯(批號20161107)、米勒海頓瓊脂(MHA，批號20160603)、干粉培養基由青島海博生物技術有限公司生產。

1.3 主要儀器 SW-CT-1F超凈工作臺：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；FA2004電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；XH-C快速混勻器SK-1：常州澳華儀器有限公司；HH.B11-420-S-Ⅱ型恒溫培養箱：上海賀德實驗設備有限公司；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司；LDZM-60KCS型全自動高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠。

1.4 試驗方法

1.4.1 耐藥菌比例的測定方法 參照影印培養法[13- 14]改良測定群落中耐藥大腸桿菌菌株的菌落數，耐藥菌氨芐西林的篩選濃度為512 μg/mL，耐藥菌落比例計算公式如下：耐藥菌落比例(%)=氨芐西林MHA培養基上菌落數/EMB瓊脂培養基上菌落數×100%。

1.4.2 耐藥大腸桿菌初始比例對耐藥菌比例的影響 0.5麥氏度耐藥大腸桿菌按照0、10%、33.3%的比例(V/V)加入到0.5麥氏度的標準大腸桿菌菌液中，37 ℃，培養7 d，每天離心，更換新培養基，并測定耐藥菌比例。

1.4.3 益生菌種類對耐藥菌比例的影響 蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等3種益生菌菌液制成0.5麥氏度，分別與含10%耐藥大腸桿菌的0.5麥氏度標準大腸桿菌菌液等體積混合，按1.4.1項方法測定1～7 d的耐藥菌比例。

1.4.4 營養水平對耐藥菌比例的影響 將含10%耐藥大腸桿菌的0.5麥氏度標準大腸桿菌菌液接種至相應濃度的LB肉湯，按1%低營養水平、10%中營養水平、100%高營養水平考察益生菌初始比例對耐藥菌比例的影響。

以上試驗組均置于恒溫振蕩培養箱中(37 ℃、200 r/min)培養，每隔1 d取出測量一次耐藥菌比例并做更換培養液等處理，連續測量7 d。

1.5 數據處理 利用SPSS 22.0軟件對測定數據進行統計和分析，采用t檢驗進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 起始比例對群落中耐藥菌比例的影響 結果如圖1所示。圖1顯示，隨培養時間的延長，2種耐藥菌起始比例群落中的耐藥菌比例在1～7 d均逐漸上升；高初始比例組的耐藥菌比例從33%上升至64%，絕對值增加31%，超過敏感菌成為群落中的優勢菌，并且1～7 d的比例均高于10%組。低初始比例組第1天從10%快速上升至36%，第7天升至43%，絕對值增加33%，升高幅度極顯著大于高比例組(P<0.01)。33%組對數趨勢線方程(y=0.1347ln(x)+0.3306)和10%組對數趨勢線方程(y=0.1318ln(x)+0.1661)斜率差異不顯著(P>0.05)，10%組對數趨勢線方程的截距0.1661極顯著地高于折線起始點0.1(P<0.01)。說明無論初始比例是高還是低，耐藥菌都沒有因攜帶耐藥基因而升高其生存適應度代價，反而獲得某種競爭優勢，使其逐步成為群落中的優勢菌；低起始比例有助于耐藥菌初期的快速生長，并可獲得比高起始比例組更高的絕對增長率。

圖1 起始比例對耐藥菌比例的影響Fig 1 Influence of initial ratios on the proportion of amp-resistant E.coli

2.2 益生菌種類對耐藥菌比例的影響 結果如圖2所示。與對照組相比較，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌在第1～7天能夠顯著降低耐藥大腸桿菌在群落中比例的升高趨勢(P<0.05)。蠟樣芽孢桿菌組中耐藥菌比例在第1天能夠降低耐藥大腸桿菌在群落中比例的升高趨勢，而第2天從21%陡然上升至43%，上升比例極顯著地大于對照組(P<0.01)，隨后又大幅滑落，第五天回落到10%附近，最終降至第7天的5%，與對照組比較差異極顯著(P<0.01)。對照組對數趨勢線方程(y=0.1278ln(x)+0.1648)、枯草芽孢桿菌組對數趨勢線方程(y=0.1257ln(x)+0.0883)、地衣芽孢桿菌對數趨勢線方程(y=0.113ln(x)+0.1019)三者斜率差異不顯著(P>0.05)，截距差異極顯著(P<0.01)。蠟樣芽孢桿菌對數趨勢線方程(y=-0.036ln(x)+0.2352)的斜率與其他三組相比差異極顯著(P<0.01)。說明枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌只能降低耐藥菌比例在各天的上升趨勢且效果相近，而蠟樣芽孢桿菌則具有降低耐藥菌的競爭適應度、促使其消亡的能力。

圖2 益生菌種類對耐藥菌比例的影響Fig 2 Influence of added probiotics on the proportion of amp-resistant E.coli

2.3 營養水平對耐藥菌比例的影響 結果如圖3所示。圖3顯示，高、中、低營養條件下，1～7 d群落中耐藥菌比例均逐步升高；三組的對數趨勢線方程分別為y=0.1422ln(x)+0.1802(10%組)、y=0.1318ln(x)+0.1661(100%)、y=0.1125ln(x)+0.1159(1%組)，1%組(低營養水平)的耐藥菌比例較其他兩組上升最慢，10%組(中營養水平)的上升最快，而100%組(高營養水平)的上升速度介于二者之間，三者的差異顯著(P<0.05)。說明耐藥菌株在一個中等營養水平環境中的相對適應度最大。

3 討論與小結

3.1 耐氨芐西林大腸桿菌G414與標準菌株競爭力比較 細菌種內和種間的競爭是塑造試管中群落結構的重要生態過程，它與個體生長速率、繁殖率、存活率等有關[15]。經典的進化論認為，當細菌在抗菌藥選擇壓力下耐藥突變菌株數量增加，獲得了在有藥環境下的生存優勢，而成為該環境下的優勢菌群；在無藥環境下，耐藥菌株攜帶和表達耐藥基因需要額外耗費細菌的資源，增加了細菌的競爭適應度代價(生存負擔)，降低其競爭適應度，而在與野生型細菌的競爭中處于劣勢，最終被稀釋，消失。很多的研究結果也證明了這個理論的正確性。但研究結果表明，除蠟樣芽孢桿菌外，其他單因素水平作用下耐藥菌株的生存競爭能力均強于標準菌株，說明本株耐氨芐西林大腸桿菌由于耐藥突變而獲得了比野生菌更強的生存能力，此結果與傳統的關于耐藥菌在無藥環境中競爭適應度下降的理論相左。此結果與Melny[16]、Andersson[17]等報道的結果相似。

圖3 營養水平對耐藥菌比例的影響Fig 3 Influence of nutritional levels on the proportion of amp-resistant E.coli

3.2 益生芽孢桿菌對耐氨芐西林大腸桿菌G414生存競爭的影響 在狹小的試管中菌群間存在著營養和生存空間等資源的競爭作用，由于自然微生物群落成份過于復雜，作用機制難以弄清，可控性差，因此，人工創建的兩個或多個物種共培養的微生物群落，利用微生物生態學方法，便于考察耐藥大腸桿菌群落組成、功能和互作效應[18]。本研究考察了大腸桿菌耐藥和標準株型之間、大腸桿菌和芽孢桿菌不同種屬之間的生存競爭。研究表明所用的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌能微弱地降低耐藥菌株的生存競爭能力，而蠟樣芽孢桿菌除第2天外均極顯著地抑制耐藥菌株的生長。這在國內外鮮有報道。若加以進一步地研究開發，用于養殖場等耐藥菌密度加大的區域，可能會在一定程度上減小環境中耐藥菌的比例。

3.3 耐氨芐西林大腸桿菌G414及使用氨芐西林的安全性 營養匱乏會增加物種間的生存競爭壓力，加速生存淘汰。本研究表明耐藥菌在高中低的營養條件下均表現出比敏感菌更強的生存競爭能力。此結果與Phan[19]等報道的結果相似。說明該耐藥菌可能獲得的突變機制不僅沒有增加其競爭適應度代價，反而降低了其競爭適應度代價，使其在惡劣環境中獲得更強的競爭優勢。以此推測，此耐藥菌在環境中有遠高于敏感菌的生存競爭能力，很容易成為優勢菌群。因此，通過停止使用藥物是不能恢復耐藥區域內細菌對相應藥物的敏感性，這將對安全用藥和人的健康構成嚴重威脅。應該從耐藥的角度來重新評估氨芐西林的使用安全性。

研究采用人工創建的多個物種共培養的微生物群落來呈現耐氨芐西林大腸桿菌在其中的比例變化，不同于目前國內外通行的以純培養微生物為對象的耐藥性研究。在后續的研究中有必要介入一些前沿的技術手段進行微生物組方面的探索，例如用轉錄組從基因的表達水平研究大腸桿菌群落耐藥基因動態表達和調控；用蛋白質組揭示群落中蛋白質的組成、豐度、相互關系，等等。把這些分析結果結合起來，推測其潛在的作用機制。此外，還可以構建數學模型，預測和描述耐藥菌株和其他細菌的生長、互作，以便于理解其群落屬性變化的基本原則，為群體水平的耐藥性研究建立基礎。相信從個體水平拓展到群落水平是未來微生物耐藥性研究發展的一個趨勢。

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