對氧磷介導氧化應激損傷人臍靜脈內皮細胞

，

(1. 南華大學附屬第二醫院藥劑科，湖南 衡陽421001；2.南華大學藥物藥理研究所)

現代醫學研究發現動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,As)是多種心血管疾病的共同病理基礎，As的發病機制涉及內皮損傷、脂質浸潤、血栓形成等方面，血管內皮細胞氧化應激損傷是As發生的始動環節[1]。有機磷酸酯類化合物(Organophosphares,Org-P)在農業防蟲抗害中應用廣泛，Org-P的代謝物對氧磷引起血管內皮細胞損傷，引起動脈粥樣硬化等疾病的發生發展[2-4]。本文探討對氧磷(Paraoxon,PO)對人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的氧化應激損傷。

1 材料與方法

1.1細胞株人臍靜脈內皮細胞株，由南華大學藥物藥理研究所中心實驗室提供。

1.2主要藥品與試劑PO購于Dr. Ehrenstorfer GmbH公司(德國)；二甲基亞砜(DMSO)，胰蛋白酶購于Sigma公司(美國)；DMEM購于Gibco(美國)；胎牛血清購于四季清(中國杭州)；BCA蛋白濃度測定試劑，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，細胞裂解液，超敏ECL化學發光試劑盒購于碧云天生物技術公司；CCK8試劑盒購于廣州奕源生物公司；抗Notch1兔單克隆抗體，抗Hes1兔單克隆抗體購于Cell Signaling Technology；抗Bcl-2兔單克隆抗體，抗Caspase3兔單克隆抗體，抗Bax兔單克隆抗體購于萬類生物科技；抗α-Tublin兔單克隆抗體購于上海瓦蘭生物科技；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG購于北京康為世紀生物技術有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒，丙二醛(Malonaldehyde,MDA)試劑盒，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)試劑盒購于中國南京建誠生物技術有限公司。

1.3 PO刺激HUVECs氧化應激損傷模型建立PO刺激HUVECs氧化應激損傷量效關系實驗:取90%融合狀態時HUVECs空白對照組、不同濃度PO(300，600，900，1 200，2 400 μm)組和溶媒對照組(0.1%DMSO)培養24 h(每組6個平行孔)。PO刺激HUVECs氧化應激損傷時效關系:通過PO量效關系實驗，選取最佳PO刺激終濃度(1 200 μm)為PO時效關系的條件，待HUVECs 90%融合狀態時，用1200 μm PO處理HUVECs，分為0，6，12，24 h四組(每組6個平行孔，其中0 h組為含有0.1% DMSO培養基)。

1.4數據分析用Graphpad prism5軟件對數據進行分析，用均數±標準差表示。多組數據平均值的差異用單因素方差分析檢驗，以P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PO刺激HUVECs氧化應激損傷量效關系

2.1.1 不同濃度PO刺激引起的HUVECs形態變化 如圖1所示，普通光學顯微鏡下觀察空白對照組HUVECs貼壁生長呈鵝卵石樣排列，生長狀態良好，細胞間緊密連接；細胞呈多角形或短梭形，大小均勻，邊界清楚；隨PO濃度增加，細胞數量變少，細胞間隔變大，細胞間出現空泡與碎片。PO(300，600 μm)組HUVECs變化不明顯，PO(1 200，2 400 μm)組細胞內空泡與碎片較明顯且細胞間排列稀疏，2 400 μm組細胞皺縮明顯，空泡與裂解碎片增多。溶媒對照組 (DMSO組)對比空白對照組細胞形態沒有明顯改變。

圖1 不同濃度PO刺激24 h后引起HUVECs的形態變化(100×)

2.1.2 CCK8法檢測PO對內皮細胞活力的影響 與空白對照組相比，HUVECs經PO處理后細胞存活率降低。設對照組細胞存活率為100%，PO(300，600，900，1200，2400μm)細胞存活率(%)分別為：1.003%±0.094%，0.928%±0.201%，0.760%±0.148%，0.525%±0.105%，0.408%±0.133%。其中PO(900,1200，2400μm)組細胞活力呈劑量依賴性降低(P<0.01)；溶媒DMSO組與空白組相比，細胞存活率(0.885%±0.186%)下降不明顯(P>0.05)。

圖2 不同濃度的PO刺激24 h后對HUVECs活力的影響(n=6)與空白對照組比較,*P<0.05

2.1.3 不同濃度PO對HUVECs中SOD活性、MDA、LDH含量的影響 HUVECs與不同濃度的PO(300，600，900，1 200，2 400μm)共同孵育24 h，測定培養液SOD活性、MDA、LDH含量。結果如表1所示：與空白對照組相比，PO(600，900，1 200，2 400 μm)組細胞中SOD活力呈現濃度依賴性減弱(P<0.01)，溶媒對照組(DMSO組)變化不明顯(P>0.05)；PO(900，1 200，2 400 μm)組MDA、LDH含量呈現濃度依賴性升高(P<0.01)，溶媒對照組(DMSO組)MDA、LDH含量無明顯變化(P>0.05)。

表1 PO對HUVECs培養液中SOD、MDA、LDH的影響(n=6)

與空白對照組比較,aP<0.05

2.1.4 不同濃度PO對 HUVECs凋亡相關蛋白表達的影響 結果如圖3，圖4顯示，不同濃度PO損傷HUVECs 24 h，通過Western blot法檢測各凋亡相關蛋白(Notch1、Hes1、Bcl2、Caspase3、Bax)表達；結果表明，與空白對照組相比，PO(1 200，2 400μm)組Notch1、Hes1、Caspase3、Bax表達顯著上調(P<0.01)，Bcl-2表達下調，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)，溶媒對照組(DMSO組)各凋亡相關蛋白表達變化不明顯(P>0.05)。

圖3 不同濃度PO刺激HUVECs 24 h后Notch1、Hes1蛋白表達變化(n=3) 與空白對照組比較,*P<0.05

圖4 不同濃度PO刺激HUVECs 24 h后細胞Casepase3表達及Bcl2/Bax比值變化(n=3)與空白對照組比較,*P<0.05

2.2 PO對HUVECs氧化應激損傷的時效關系

2.2.1 不同時間PO刺激HUVECs對細胞形態的影響 經前面的量效關系實驗可知1 200 μm的PO處理HUVECs，細胞損傷最明顯。故選用1 200 μm的PO分別刺激HUVECs不同時間(0，6，12，24 h)后在顯微鏡下觀察，如圖5顯示，0 h組HUVECs貼壁生長呈鵝卵石樣排列，生長狀態良好，細胞間緊密連接，細胞呈多角形或短梭形，大小均一，邊界清楚；隨損傷時間延長，細胞形態逐漸發生變化，細胞內出現空泡與碎片，細胞數目減少，脫落增多。

圖5 1 200 μm PO損傷HUVECs不同時間后細胞形態變化(100×)

2.2.2 不同時間PO刺激HUVECs對細胞活力的影響 如圖6所示，與0 h組相比， PO(12 h，24 h)組細胞活力呈時間依賴性下降(P<0.05)。

圖6 1 200 μm PO作用于HUVECs不同時間對細胞活力的影響(n=6)與0 h組比較，*P<0.05

2.2.3 不同時間PO對HUVECs培養液中SOD、MDA、LDH含量的影響 如表2所示，與0 h組相比，隨著PO處理HUVECs時間的延長，細胞內SOD含量逐漸降低，PO(12 h, 24 h)組SOD含量呈時間依賴性顯著降低(P<0.01)。與0 h組相比，隨著時間延長，細胞內MDA、LDH含量逐漸增加，PO(12 h，24 h)組MDA、LDH含量呈時間依賴性顯著增加(P<0.01)。

表2 不同時間PO刺激HUVECs的SOD、MDA、LDH含量的影響(n=6)

與0h比較，aP<0.05

2.2.4 不同時間PO對HUVECs凋亡相關蛋白表達的影響 由圖7-8可知，Western blot分析結果顯示，與0 h對照組相比，隨著PO處理HUVECs時間延長，PO(12 h，24 h)組Notch1、Hes1、Caspase3、Bax表達增加(P<0.05)，同時Bcl-2表達下降，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)。

圖7 1 200 μm PO作用于HUVECs不同時間后Notch1、Hes1蛋白變化表達(n=3)與0 h組比較，*P<0.05

圖8 1 200 μm PO作用于HUVECs不同時間后Casepase3表達及Bcl2/Bax比值變化(n=3)與0 h組比較，*P<0.05

3 討 論

動脈粥樣硬化是一種多因素誘發的疾病，它涉及到年齡、飲食習慣、感染與環境等因素，發病機理十分復雜，至今尚未完全闡明。有文獻報道長期與有機磷酸酯類殺蟲劑接觸對心血管疾病的發生有密切關系[5-6]，還有研究表明長期使用農藥的花匠與牧民會增加患心血管疾病的風險[7-9]。LDH是細胞內的糖酵解酶，廣泛存在于細胞漿內，培養液中 LDH 漏出增加顯示細胞遭到破壞或細胞膜通透性增加，細胞或細胞膜損傷的程度可通過LDH水平高低反映出來[10]。研究表明內皮細胞氧自由基產生脂質過氧化程度的增加時，MDA含量的升高， DNA合成抑制，阻礙內皮細胞損傷修復，促進動脈粥樣硬化的發生發展[11]。正常細胞內的SOD 等內源性抗氧化酶系，可通過代謝轉化清除活性氧，抑制動脈粥樣硬化的發生發展[12-13]。本課題組近年來對有機磷酸酯類農藥產生的心血管危害作用及機制做了大量的研究，前期試驗已成功建立敵百蟲加速的遠交群大鼠 (Sprague Dawley Rat, SD Rat)As模型[14]，用有機磷酸酯類農藥敵百蟲給家兔長期灌胃，發現兔血管形態明顯改變以及血管內皮功能的損傷[15]。人體內的一些基因與生理病理條件下的程序式細胞調亡有關，已證實凋亡調節因子參與細胞的調控，Bcl-2基因可抑制多種細胞的凋亡，Bax是細胞凋亡的啟動子，Bcl-2/Bax比值反應細胞凋亡的程度；Bax促進Caspase表達，介導細胞凋亡[16-17]。王寧等用姜黃素拮抗內皮細胞的氧化應激反應主要是通過調節Notch1信號通路發揮減輕細胞凋亡的作用[18]。研究發現Notch1信號通路在內皮細胞的間質化、內皮細胞增生以及凋亡過程中發揮著重要作用[19]。有文獻報導血管內皮細胞中Notch 1促進Hes 1的表達[20]。

本實驗用對氧磷誘導人臍靜脈內皮細胞建立氧化應激損傷的模型，發現PO呈濃度與時間依賴性介導人臍靜脈內皮細胞氧化應激損傷，引起內皮細胞的形態改變(如細胞萎縮以及細胞間隙增寬等)，內皮細胞活力SOD明顯降低，MDA、LDH含量逐漸增加；本實驗也觀察到Caspase3、Bax、Notch1、Hes1的表達上調，而Bcl-2表達和Bcl-2/Bax比值下降，PO對內皮細胞產生明顯的氧化應激損傷。

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