小粒徑辛伐他汀盤狀重組高密度脂蛋白載藥系統的制備及體外評價

楊蕓 張文麗 劉建平

【摘 要】目的：體外制備小粒徑辛伐他汀盤狀重組高密度脂蛋白載藥系統，對其理化性質進行表征并觀察載藥系統對泡沫細胞存活率的影響。方法：利用乙醇注入-超聲分散法制備辛伐他汀脂質體，借助膽酸鈉介導載脂蛋白apoA-I與脂質結合，構建盤狀重組高密度脂蛋白載藥系統。對載藥系統的理化性質進行表征，并進行MTT實驗測定泡沫細胞存活率。結果：載藥系統為40 nm左右的盤狀，長軸方向上的直徑在100 ～ 200 nm，盤的側面高度在50 nm以下。藥物包封率在80 %以上，載藥量約為2.8 %，在4℃放置7天內穩定性良好。apoA-I與脂質結合后其α-螺旋含量上升，與脂質結合的穩定性有所提高。載藥系統與泡沫細胞孵育后，細胞存活率有所升高。結論：體外成功制備了小粒徑辛伐他汀盤狀重組高密度脂蛋白載藥系統，該系統對泡沫細胞的病理凋亡具有一定的治療作用。

【關鍵詞】 盤狀重組高密度脂蛋白；辛伐他??；載脂蛋白apoA-I；泡沫細胞

【中圖分類號】R743 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）04-00-01

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種動脈壁的慢性炎癥疾病，與冠狀動脈疾病、心肌梗塞等多種血管疾病的發生有關[1]。巨噬細胞存在于AS的各個病理階段，參與斑塊炎癥反應、纖維帽變薄、壞死核心形成及斑塊破裂等多個病理過程[2，3]。因此，將巨噬細胞作為治療AS的靶點具有重要的研究意義。

高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）是一種存在于血漿中的天然脂蛋白，直徑在7～13 nm，由多種生物大分子組成[4，5]。載脂蛋白A-I（apolipoprotein A-I，apoA-I）是HDL上含量最為豐富的蛋白成分，約占HDL蛋白含量的70 %。此外HDL上還包括一些其他的脂質成分，如膽固醇、膽固醇酯、甘油三酯以及磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂等多種磷脂。HDL能夠移除外周組織多余的膽固醇，遞送肝臟進行代謝消除，這一過程即為膽固醇逆轉運（reverse cholesterol transport，RCT）[5，6]，RCT被認為是HDL抗AS的主要機制[4]。此外，HDL還具有抗炎、抗氧化等多種生理功能[7]，同樣能夠起到抗AS的治療作用。

目前，國內外已有學者體外制備重組HDL（reconstituted HDL，rHDL），具有與天然HDL相類似的組成、性質及結構，并具有良好的生物相容性、生物可降解性等優勢，可將其作為化藥[8]、基因[9]或造影劑[10]的載體。他汀類藥物具有降血脂、抗炎抗氧化等藥理效用，可用于抗AS。口服治療劑量的他汀類藥物主要在肝臟發揮降脂作用，若要達到抑制斑塊的作用，則需要口服5 ～ 7倍的劑量[11]，如此會產生一定的肝毒性并伴隨有肌病等一系列副作用。因此，將脂溶性他汀類藥物載入rHDL中，可降低毒副作用，同時實現藥物與載體抗AS的協同作用。

本實驗室前期采用薄膜分散法制備載他汀類藥物的rHDL[12]，該方法中使用的氯仿具有高毒性。本文以辛伐他?。╯imvastatin，ST）作為模型藥，采用乙醇注入-超聲分散法制備辛伐他汀脂質體（ST loaded liposome，ST-liposome），避免采用高毒性有機溶劑，此外制備過程中不加入膽固醇，以盡量減少促AS發展的不良因素的引入。將脂質體與apoA-I蛋白樣品孵育，得到小粒徑辛伐他汀重組高密度脂蛋白載藥系統（ST-loaded rHDL，ST-rHDL）。對制備得到的載藥系統進行粒徑、包封率（entrapment efficiency，EE）及載藥量（drug-loading rate，DL）測定，以透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）、原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）觀察其形態特征，并利用圓二色光譜（circular dichroism，CD）及鹽酸胍（guanidine hydrochloride，Gdn-HCl）變性實驗研究apoA-I的二級結構及其與脂質結合的穩定性，最后觀察ST-rHDL對RAW 264.7巨噬細胞源性泡沫細胞存活率的影響。

1 實驗材料

1.1 試劑 大豆磷脂（上海艾韋特醫藥科技有限公司）；辛伐他汀原料藥（上虞京新藥業有限公司惠贈）；膽酸鈉（北京索萊寶科技有限公司）；Tris（生興生物公司）；Sephadex G50（50-150 μm，瑞典pharmacia公司）；apoA-I蛋白樣品（實驗室從FIV沉淀中提?。?；DMEM細胞培養基（維森特生物技術有限公司）；胎牛血清FBS（維森特生物技術有限公司）；四甲基噻唑藍MTT（sigma）；ox-LDL（廣州奕源生物科技有限公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為市售分析純

1.2 儀器 JY-92II超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RE-85Z旋轉蒸發儀（鞏義市英峪予華儀器廠）；動態光散射儀（Brookhaven）；RF-5301PC熒光分光光度計（島津）；高效液相色譜儀（島津）；紫外分光光度計（南京科爾儀器設備有限公司）；J810圓二色光譜儀；透射電鏡（Hitachi）；原子力顯微鏡（VEECO）

1.3 細胞 RAW 264.7巨噬細胞（南醫大惠贈）

2 實驗方法

2.1 藥物含量測定方法的建立

2.1.1 HPLC方法的建立 對一定濃度的ST-甲醇溶液在200～400 nm波長范圍內進行紫外掃描，確定藥物的檢測波長為238 nm。色譜柱：Kromasil ODS C18柱（5 ?m，250 mm×4.6 mm）；流動相：甲醇：水（78：22，v/v）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：50 μl。

2.1.2 HPLC方法專屬性 將一定濃度的ST-甲醇溶液及用甲醇破乳稀釋的空白rHDL載體分別進行HPLC檢測。

2.1.3 標準曲線的建立 用甲醇配制濃度分別為0.5、1、2、10、20、50、100 μg/ml的ST標準溶液，進行HPLC檢測，以峰面積對ST濃度作圖得到標準曲線。

2.1.4 回收率及精密度考察 用甲醇配制濃度分別為0.5、10和100 μg/ml的ST標準溶液，加入一定體積的空白rHDL載體，進行HPLC檢測，計算回收率及RSD值。取回收率所用樣品溶液，于一天內三個不同時間及連續三天的同一時間進樣，得到日內、日間精密度并計算RSD值。

2.2 ST-rHDL的制備 稱取處方量的大豆磷脂和ST放入西林瓶中，無水乙醇溶解，此為有機相。另取一定體積Tris-HCl緩沖液（含膽酸鈉）于另一西林瓶中作為水相。將有機相加熱至65℃，勻速緩慢滴入相同溫度下持續攪拌的水相中。滴加結束后繼續保溫攪拌1 h，超聲分散后旋轉蒸發除去乙醇，用緩沖液定容至適當體積后過濾得到ST-liposome混懸液。將混懸液與apoA-I蛋白樣品室溫孵育，過濾即得ST-rHDL。

2.3 ST-rHDL的理化性質表征 2.3.1 粒徑測定

將ST-liposome及ST-rHDL稀釋一定倍數后，利用動態光散射法（dynamic light scattering，DLS）測定粒徑及多分散指數（polydispersity index，PDI）。

2.3.2 EE及DL測定 用葡聚糖微柱離心法分離ST-rHDL和游離藥物，進行HPLC檢測并計算藥物濃度。取相同體積的ST-rHDL直接用甲醇破乳稀釋，進行HPLC檢測并計算藥物濃度。按下述公式（1）計算EE：EE （%）= C/C0 × 100 % （1）式中，EE為藥物的包封率；C為rHDL中包裹的藥物濃度；C0為rHDL混懸液中的藥物總濃度。

按下述公式（2）計算DL：DL （%）= W/W0 × 100 % （2）式中，DL為載藥量；W為rHDL中包裹的藥物總量；W0為ST-rHDL的藥物和輔料的總重量。

2.3.3 TEM形態觀察 將ST-liposome及ST-rHDL稀釋后滴到碳膜覆蓋的銅網上，用磷鎢酸溶液（2.0%，w/v）于室溫下染色樣品，烘干后進行TEM觀察。

2.3.4 AFM形態觀察 將ST-rHDL稀釋后滴于1 cm × 1 cm的玻璃片上，烘干后進行AFM觀察。

2.3.5 apoA-I的二級結構檢測 將apoA-I蛋白樣品及ST-rHDL進行透析，除掉鹽分。以去離子水作為空白背景，檢測190 ～ 250 nm波長范圍內的CD光譜。用蛋白二級結構預測軟件計算α-螺旋，β-折疊，β-轉角和無規卷曲所占百分比。

2.3.6 apoA-I與脂質結合的穩定性考察 配制一系列濃度的Gdn-HCl溶液，與等體積ST-rHDL或apoA-I蛋白樣品溶液混合，使得Gdn-HCl濃度分別為0、1、2、4、5、6、8、10、12 M，24 h后用熒光分光光度計測定最大熒光發射波長，固定激發波長為280 nm。

2.3.7 放置穩定性考察 將ST-rHDL置于4 ℃儲存，分別于1、4、7天后，測定其粒徑及EE。

2.4 泡沫細胞存活率檢測 取對數生長期的RAW 264.7細胞以5000個細胞/孔的密度接種于96孔板，以含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM細胞培養基于5 % CO2，37 ℃培養箱中培養細胞貼壁，以60 μg/ml的ox-LDL繼續培養24 h以誘導細胞泡沫化。PBS清洗后，加入無血清培養基稀釋的ST-rHDL（磷脂濃度分別為50、100、200、400、600和800 μg/ml），37 ℃孵育6 h。PBS清洗后，加入含 MTT的無血清培養基，37 ℃孵育4 h。移除培養液，加入DMSO溶解藍紫色甲瓚結晶，用酶標儀于570 nm測OD值。此外，設計一組泡沫細胞以不含ST-rHDL的無血清培養基培養6 h觀察存活情況。每個樣品六復孔，根據下式計算細胞存活率：

其中，ODcontrol為僅用空白培養液不加藥處理的含細胞的對照孔的OD值，ODs 為加藥處理的供試孔的OD值，OD0 為無細胞的空白孔的OD值。

3 結果和討論

3.1 藥物含量測定方法的建立

3.1.1 HPLC方法專屬性

如圖1所示，藥物出峰時間在13 ～ 14 min，輔料對藥物的檢測沒有干擾，該方法專屬性良好。

3.1.2 標準曲線的建立

標準曲線方程為：Peak area=-65589.25726 + 99935.36131×C，R2 = 0.9999。ST濃度在0.5 ～ 100 μg/ml范圍內峰面積與濃度成正比，線性關系良好。

3.1.3 回收率及精密度考察

在低、中、高三種濃度下的回收率均在98～102%之間，RSD值均小于2%，且三種濃度下的日內、日間精密度的RSD值均小于2%，符合方法學要求。

3.2 ST-rHDL的理化性質表征

3.2.1 粒徑測定

結果如表1所示，ST-liposome粒徑約為40 nm，孵育apoA-I蛋白樣品形成ST-rHDL之后，其粒徑沒有發生明顯改變，粒徑仍在40 nm左右。

3.2.2 EE及DL測定

以相同處方工藝條件制備三批ST-rHDL經葡聚糖凝膠微柱離心法分離載體與游離藥物并進行HPLC檢測，計算得到的 EE為（85.09 ± 0.57）%，DL為（2.80 ± 0.02）%。

3.2.3 TEM形態觀察

圖3 （A）ST-liposome，形態為不規則的球形，原因可能是脂質材料中不含膽固醇，因此磷脂雙層膜的流動性較強，容易變形。圖3（B）為ST-rHDL，明顯看出載體呈盤狀，且堆積在一起。TEM比例尺為200nm，可見粒徑平均在40nm左右，與DLS檢測結果一致。

3.2.4 AFM形態觀察

如圖4所示，ST-rHDL形態為盤形，長軸方向的直徑在100～200 nm之間，盤的側面高度小于50 nm。

3.2.4 apoA-I的二級結構檢測

根據CD譜圖預測得到的二級結構各百分含量如表2所示，游離apoA-I與rHDL的脂質結合之后，構象發生了一定改變，各二級結構所占百分比含量都發生了不同程度的變化。如α-螺旋含量升高，一定程度上能夠促進蛋白與脂質之間的結合[13]。

3.2.5 apoA-I與脂質結合的穩定性考察

如圖5所示，將游離apoA-I與不同濃度的Gdn-HCl溶液孵育相同時間后，其最大熒光發射波長有所改變。隨著Gdn-HCl溶液濃度增大，游離apoA-I的最大熒光發射波長逐漸增大，說明apoA-I在Gdn-HCl作用下發生變性，構象發生明顯改變。相比之下，apoA-I與脂質結合后，其穩定性有所提高，耐受Gdn-HCl的能力增強。

3.2.6 放置穩定性

將ST-rHDL于4 ℃放置7天，期間制劑粒徑及EE均未發生明顯改變，放置穩定性良好。

3.3 泡沫細胞存活率檢測

不同濃度載藥制劑對泡沫細胞存活率的影響如圖6所示，泡沫細胞存活率均大于100%。泡沫細胞不加制劑同樣培養6 h后的細胞存活率以培養0 h為對照，結果顯示，泡沫細胞本身活性會下降，存活率降至60%。因此，載藥制劑對泡沫細胞起到了一定的治療作用，如介導膽固醇外流、制劑攝取進入細胞以使藥物發揮作用等，使得細胞泡沫化程度有所緩解，存活情況改善。但制劑濃度過大時，由于高的脂質濃度，本身會有一定細胞毒性。

4 結論

本文利用乙醇注入-超聲分散法制備了不含膽固醇的辛伐他汀脂質體，避免使用高毒性有機溶劑，同時減少了不利于抗AS的成分的引入，借助膽酸鈉介導載脂蛋白與脂質結合，構建小粒徑盤狀重組高密度脂蛋白載藥系統，該系統對泡沫細胞的病理凋亡具有一定的緩解作用，提高細胞存活率。該載藥系統粒徑相對較小，有利于體內靶向遞送時穿透斑塊組織表面的纖維帽結構，到達深層泡沫細胞發揮治療作用，為后續載體的進一步優化設計及體內靶向研究提供了一定的研究基礎。

參考文獻

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