綠藻中提取的硫酸鼠李糖對酶的抑制作用研究

張洋

摘 要：該文研究了從太平洋沿岸、浙江沿海地區(qū)的天然綠藻中提取硫酸化多糖的高效方法。通過對比鹽酸處理法、酶處理法、高溫加熱酶處理法提取硫酸鼠李糖的得率，高溫加熱酶處理法最為高效。其次該種硫酸化多糖對各種生物酶的活性抑制實驗表明，硫酸鼠李糖對透明質(zhì)酸酶和彈性蛋白酶的活性抑制能力較強，對膠原蛋白酶活性無抑制作用，對絡(luò)氨酸酶活性有一定抑制作用。證明綠藻中提取的硫酸鼠李糖對于人體的保濕性能、抗黑色素生成性能以及維持肌膚彈性方面均有作用，為其今后在護(hù)膚品行業(yè)和健康保健食品方面的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：綠藻；硫酸化多糖；硫酸鼠李糖；生物活性酶；酶的抑制作用

中圖分類號 R285 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）10-0011-03

Research on Enzyme Inhibition of Rhamnan Sulfate from Monostroma nitidum

Zhang Yang

（Wuhu Institute of Technology，Wuhu，241003，China）

Abstract：This paper studies the efficient method of extracting sulfated polysaccharide from the natural algae（Monostroma nitidum） from the Pacific coast and Zhejiang coastal areas. The author compared the receiving rates of rhamnan sulfate extracted respectively by means of hydrochloric acid treatment，enzyme treatment，and high-temperature heating enzyme treatment and concludes that the third method is the most efficient. In the next place，the experiment to study the inhibition effect of such sulfated polysaccharide on the activity of various bio-enzymes suggests that rhamnan sulfate has a relatively strong inhibiting ability on the activity of hyaluronidase and elastase，but exerts no inhibiting effect on the activity of collagenase，and has a certain inhibiting impact on the activity of tyrosinase. This proves that rhamnan sulfate extracted from the algae plays a certain role in moisturizing human body，preventing the production of melanin and maintaining skin elasticity，which provides a theoretical basis for its future development in skin care industry and dietary supplement.

Key words：Monostroma nitidum；Sulfated polysaccharides；Rhamnan sulfate；Bioactive enzyme；Enzyme inhibition

硫酸化多糖也稱多糖硫酸脂或硫酸脂多糖，是指糖羥基上帶有硫酸根的多糖，主要來源天然提取和化學(xué)合成。據(jù)以往的研究[1]，綠藻中存在大量含有硫酸基的多糖物質(zhì)。硫酸化多糖有硫酸軟骨素（chondroitin sulfate）、巖藻多糖（fucoidan）、香菇多糖（lentinan）等，存在于海藻、動植物體內(nèi)，這些硫酸化多糖具有抗病毒、抗腫瘤、抗癌、治愈外傷等多種生理活性作用。早在1982年，日本Sugawara等[2]發(fā)現(xiàn)某些勻多糖的硫酸脂如卡拉膠是一種有效的淋巴細(xì)胞的促細(xì)胞分裂源，Nakashima等[3]發(fā)現(xiàn)卡拉膠和肝素等還具有抑制皰疹病毒復(fù)制的作用。但是如果將這些多糖的硫酸根除去，則這些活性都將消失[4]。日本學(xué)者對多種海藻中提取的各種硫酸化多糖的研究表明，這些硫酸化多糖的活性隨多糖的分子量及硫酸根的含量而變化，一般認(rèn)為多糖分子量在5000～60000，硫酸根含量在每單位糖殘基平均含1.5～2.0為最佳。目前為止，日本和法國對綠藻多糖的研究報道較多[5]，而我國對綠藻多糖的研究較少。大量的研究表明，從綠藻中提取的天然多糖，來源廣泛，品種多，毒副作用低，安全性能高，具有多種生物活性。

隨著人民生活水平的提高，綠藻中提取的天然硫酸化多糖在化妝品及生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用勢必將成為近年來研究開發(fā)的熱點。本研究將解決如何簡單高效的從浙江沿海的一種綠藻中提取一種名為硫酸鼠李糖（rhamnan sulfate）的硫酸化多糖。這種綠藻主要分布在我國南部各沿海省份，另外從日本本州的太平洋沿岸到九州、南西諸島以及朝鮮半島都有較多分布，在冬季從初夏潮間帶的巖上生長，為長度4～10cm的葉狀。

以往對硫酸化多糖生物活性的研究大多集中在醫(yī)療領(lǐng)域，主要表現(xiàn)在它的抗凝血作用、抗腫瘤、抗病毒、抗HIV活性，這些硫酸化多糖大部分提取自動植物組織內(nèi)。而本研究著眼于從綠色海藻中提取硫酸化多糖，并主要分析其對于人體的保濕、抗黑色素生成、以及維持肌膚彈性性能的影響。

透明質(zhì)酸具有保濕、高粘性、修復(fù)炎癥等性質(zhì)。而透明質(zhì)酸會被透明質(zhì)酸酶水解，隨著年齡的增長，體內(nèi)透明質(zhì)酸的量會減少。所以抑制透明質(zhì)酸酶的活性或者使透明質(zhì)酸酶活性低下，就可以使透明質(zhì)酸保持一定量不流失，維持皮膚的健康狀態(tài)。抑制透明質(zhì)酸酶的活性，會對人體皮膚的保濕方面起到積極作用。而對膠原蛋白酶的活性抑制將會阻止膠原蛋白被水解，對絡(luò)氨酸酶的活性抑制會使得黑色素的生成受到阻礙，抑制彈性蛋白酶的活性可使得肌膚保持彈性。本研究主要探討了從綠藻中提取的硫酸鼠李糖對這些酶的活性的抑制程度。

1 材料與主要儀器

1.1 材料 浙江沿海產(chǎn)綠藻；p-DABA，日本和光純藥株式會社；EDTA，日本和光純藥株式會社；Compound48/80，日本Sigma會社。

1.2 主要儀器 臺式高速離心機TG16-W，長沙湘智離心機儀器有限公司；恒溫振蕩器HZ-C，太倉市實驗設(shè)備廠；超聲波清洗機XO-3200DT，南京先歐儀器制造有限公司；電子天平BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；紫外可見分光光度計UV-1800，日本島津公司；高速大容量冷卻離心機7780Ⅱ，日本久保田公司。

2 研究方法

2.1 綠藻中提取硫酸鼠李糖

2.1.1 鹽酸處理法 20g干燥海藻粉末加蒸餾水600mL溶解，1M鹽酸調(diào)制溶液pH至3.0，60℃、3h攪拌。用硅藻土過濾后，加0.5MNaOH中和，加乙醇溶解，得到沉淀物，用蒸餾水再溶解，再次乙醇溶解，回收沉淀物，用超純水再溶解，透析膜經(jīng)過20h透析，將透析膜內(nèi)液凍結(jié)干燥后，得到精制硫酸化多糖粉末。

2.1.2 酶處理法 20g干燥海藻粉末加蒸餾水600mL溶解，加纖維素酶0.2g，45℃、24h攪拌。之后操作與酸處理法相同，得到精制硫酸化多糖粉末。

2.1.3 高溫加熱酶處理法 20g干燥海藻粉末加蒸餾水600mL溶解，高溫滅菌鍋121℃、15min加熱滅菌，室溫冷卻后，加纖維素酶0.2g，45℃、24h攪拌。之后操作與酸處理法相同，得到精制硫酸化多糖粉末。

2.2 硫酸鼠李糖對生物酶的活性抑制實驗

2.2.1 對透明質(zhì)酸酶活性抑制實驗 透明質(zhì)酸酶溶液50μL添加至100μL硫酸鼠李糖（RS）樣品中，37℃、20min恒溫振蕩反應(yīng)。添加活性化溶劑Compound48/80溶液100μl，37℃、20min恒溫振蕩反應(yīng)。添加透明質(zhì)酸鈉溶液250μl，37℃、40min恒溫振蕩反應(yīng)。添加0.4M氫氧化鈉溶液100μl后反應(yīng)中止，添加硼酸溶液100μL，3min水浴煮沸。冷卻至室溫后，添加p-DABA溶液3mL，37℃、20min恒溫振蕩反應(yīng)。波長585nm下測定溶液吸光度。

2.2.2 對膠原蛋白酶活性抑制實驗 膠原蛋白酶溶液50μL添加至50μL硫酸鼠李糖（RS）樣品中，添加Pz-肽（Pz-pro-leu-Gly-pro-D-Arg）溶液400μL，37℃、30min恒溫振蕩反應(yīng)。添加25mM檸檬酸溶液1mL后反應(yīng)停止。然后添加乙酸乙酯溶液5mL，激烈振動試管，離心機3000rpm、10min離心分離，取乙酸乙酯層在波長320nm下測定溶液吸光度。

2.2.3 對絡(luò)氨酸酶活性抑制實驗 硫酸鼠李糖（RS）樣品0.9mL中添加0.3mg/mL絡(luò)氨酸溶液300μL、0.1M磷酸緩沖溶液（pH6.8）1mL，37℃、10min恒溫振蕩反應(yīng)。再添加絡(luò)氨酸酶溶液100μL，37℃、40min恒溫振蕩反應(yīng)。添加2M疊氮化鈉溶液后反應(yīng)停止，波長475nm下測定溶液吸光度。

2.2.4 對彈性蛋白酶活性抑制實驗 彈性蛋白酶溶液25μL添加至50μL硫酸鼠李糖（RS）樣品中，放置冰箱中4℃條件下15min反應(yīng)添加8mM基質(zhì)（N-Methoxysuccinyl-L-Alanine-L-Alanine-L-Prolyl-L-Valine-p-Nitroanilide）溶液25μL，室溫下30min放置反應(yīng)，波長405nm下測定溶液吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 綠藻中提取硫酸鼠李糖 表1對比3種方法從綠藻中提取硫酸鼠李糖的得率，最高的為高溫加熱酶處理法。

表1 不同方法從綠藻中提取硫酸鼠李糖的得率

[提取方法 得率（%） 鹽酸處理法 20 酶處理法 16 高溫加熱酶處理法 28→24* ]

注：高溫加熱酶處理得到的硫酸鼠李糖得率為28%，碘與淀粉反應(yīng)測試出提取物中還含有淀粉成分，固用淀粉酶分解淀粉后的得率為24%。

3.2 硫酸鼠李糖對生物酶的活性抑制

3.2.1 對透明質(zhì)酸酶活性抑制 測得的吸光度數(shù)值根據(jù)下列公式計算對酶活性的抑制率：

[抑制活性（%）=1-（S-SB）（C-CB）×100]

式中：S：樣品；SB：空白試樣；C：對照組；CB：空白對照。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.7mg/mL濃度的cromolyn溶液對透明質(zhì)酸酶抑制活性為71.34%，0.7mg/mL樣品溶液對透明質(zhì)酸酶抑制活性為25.16%，相比較標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)較弱，說明硫酸鼠李糖對透明質(zhì)酸酶活性有抑制作用。

3.2.2 對膠原蛋白酶活性抑制 測得的吸光度數(shù)值根據(jù)同上公式計算對酶活性的抑制率，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)EDTA溶液濃度0.025M（9.3mg/mL）對膠原蛋白酶抑制活性為70.95%，1.0mg/mL、5.0mg/mL、10.0mg/mL樣品溶液對透明質(zhì)酸酶抑制活性均為0%，說明硫酸鼠李糖對膠原蛋白酶活性沒有抑制作用。

3.2.3 對絡(luò)氨酸酶活性抑制 測得的吸光度數(shù)值根據(jù)同上公式計算對酶活性的抑制率，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲酸（kojic acid）溶液濃度5mM（0.71mg/mL）對膠原蛋白酶抑制活性為76.20%，1.0mg/mL、15.0mg/mL樣品溶液對絡(luò)氨酸酶抑制活性分別為1.88%和21.87%，隨著硫酸鼠李糖濃度的增加對絡(luò)氨酸酶活性抑制作用逐漸增加，說明硫酸鼠李糖對絡(luò)氨酸酶活性有一定抑制作用。

3.2.4 對彈性蛋白酶活性抑制 測得的吸光度數(shù)值根據(jù)同上公式計算對酶活性的抑制率，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)彈性蛋白溶液濃度0.0054mg/mL對彈性蛋白酶抑制活性為58.60%，1.0mg/mL樣品溶液對彈性蛋白酶抑制活性為24.89%，說明硫酸鼠李糖對彈性蛋白酶活性有抑制作用。

4 結(jié)論

本文研究從天然綠藻中提取硫酸鼠李糖的方法，并探究RS對各種酶活性的抑制程度，得到如下結(jié)論：高溫加熱酶處理法提取RS最為高效，其得率為24%；RS對各種生物酶的活性抑制實驗表明，RS對透明質(zhì)酸酶和彈性蛋白酶的活性抑制能力較強，對膠原蛋白酶活性無抑制作用，對絡(luò)氨酸酶活性有一定抑制作用。證明綠藻中提取的RS對于人體的保濕性能、抗黑色素生成性能以及維持肌膚彈性方面均有作用，這為其今后在護(hù)膚品行業(yè)和健康保健食品方面的發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]劉曉蕙，張翼伸.海帶中褐藻糖膠的分級純?nèi)A與結(jié)構(gòu)研究[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，1992，24（4）：297-302.

[2]Sugawara I，Ishizaka S，Moller G.Carrageenans，highly sulfated polysaccharides and macrophage-toxic agents：newly found human T-lymphocyte mitogens[J].Immunobiology，1982（163）：527.

[3]Nakashima H，Kido Y，Kobayashi N，etal.Antiretroviral activity in a marine red alga reverse transcriptase inhibition by an aqueous extract of Schizymeniapacifica.[J].Cancer Res Clin Oncol，1987（113）：413.

[4]Sugawara I，Ishizaka S，Desulfatedcarrageenans and cyto-toxicity of human monocytes[J].Agents and Actions，1983（13）：345.

[5]王艷梅，李智恩，徐祖紅.孔石莼化學(xué)組分和藥用活性研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué)，2000，24（3）：25-28. （責(zé)編：王慧晴）