高原不同人群體外紅細胞無氧酵解能力的差異*

吳顯熠　張中偉　吳小東　馮露　鄒茜婷　楊超

(1.四川大學華西醫院西藏駐成都辦事處分院重癥醫學科，四川 成都 610000；2.四川大學華西醫院重癥醫學科，四川 成都 610000)

高原紅細胞增多癥( high altitude polycythemia，HAPC ) 是一種高原低氧環境下所致的慢性疾病，主要表現為紅細胞與血紅蛋白代償性增多，引起血液黏稠度增高，全血比黏度增高，進而引起循環阻力增高，加重心臟負荷和組織缺氧，產生一系列癥狀和體征的臨床綜合征[1]。HAPC 的基本治療包括吸氧、 抗凝、血液稀釋等[2]。有研究表明，血液稀釋療法是降低紅細胞數量、控制血液粘滯度的有效手段[3]。基本方法是輸入適當的各種稀釋液或放血，以期使血液濃度變稀，血細胞比容、胞粘稠度降低，從而改善增加局部血液流量，起到治療疾病的治療方法[4]。但HAPC患者放血療法的血液在臨床上常廢棄，未再利用。隨著我國醫療衛生事業的不斷發展，臨床用血逐年上升，血液供應日益緊張[5]。現獻血人群主要來自健康人群。若此類患者可作為無償獻血者，一定程度上可達到治療目的，也可增加血液資源。

紅細胞在體內主要功能是運輸O2和CO2，而無氧酵解是紅細胞維持自身結構和功能穩定的能量來源。成熟紅細胞因沒有線粒體，幾乎完全依賴血漿中攝取葡萄糖，經一系列酶促反應，完成無氧酵解，產生ATP，其中LDH是無氧酵解中一種主要的催化酶。ATP是紅細胞能量代謝的重要產物，具有維持紅細胞膜ATP酶運轉、啟動糖酵解通路、維持紅細胞正常的雙凹形態以及紅細胞的血液流變學特性等多項功能[6]。本文通過采集不同Hb水平的高原人群組與平原正常人群組血液制成紅細胞懸液，在血液體外保存條件下對懸浮紅細胞無氧酵解能力相關指標進行對比檢測分析，初步探討其高原人群和平原人群體外保存懸浮紅細胞無氧酵解能力的不同，從代謝水平分析紅細胞功能差異。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑BC-5800 血細胞計數儀(深圳邁瑞);HITACHI全自動生化分析儀(日本日立儀器有限公司);葡萄糖試劑盒(批號：20130405137，上海榮盛生物藥業有限公司);鄰聯甲苯胺(批號：20100609)， ATP檢測試劑盒。

1.2實驗分組收集西藏自治區駐成都辦事處醫院2016年12月5日～2017年1月16日期間受檢的30例健康男性志愿者，年齡18～65歲。根據Hb水平和居住地區將志愿者分為A、B、C 3組，A組(高原紅細胞增多組)：世居高原(海拔≥3500m)，Hb≥180g/L；B組(高原正常人群組)：世居高原(海拔≥3500m)，Hb120～160g/L；C組(平原正常人群組)：世居平原地區(海拔<2500m)，Hb120～160g/L。

1.3懸浮紅細胞制備采集志愿者全血200ml，同時另外采集10ml全血作為待檢樣本立即進行檢測。將全血標本離心后去除大部分血漿，每份全血離心后加50ml MAP紅細胞保存液，制備得到懸浮紅細胞。再將每份懸浮紅細胞分裝到4個50ml轉移袋中，于-40℃冰箱保存，于第 1、7、21、35d分別取樣檢測。

1.4檢測指標及方法

1.4.1血常規于采血當天取全血及于保存第1、7、21、35d取懸浮紅細2ml用血細胞計數儀測定紅細胞計數、Hb濃度、HCT、紅細胞平均體積(MCV)。

1.4.2葡萄糖、LDH將懸浮紅細胞于3000g離心5 min取上清，然后用電解質檢測儀直接檢測。

1.4.3ATP 分別在洗滌前/后取樣，每例10μl，加入裂解液1000μl，用微量移液器輕輕洗吸6次混勻，得到樣品裂解液(樣1)，用生理鹽水稀釋400倍(樣2)待測，全部操作在冰浴進行，取ATP檢測試劑及ATP檢測試劑稀釋液，按1:9(V/V)混合，室溫放置3～5min，取100μl樣2加入96孔板，立即上機檢測。ATP檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司；編號：S0026)

2　結果

2.13組人群初始狀態外周全血常規檢測結果A組紅細胞計數、Hb、HCT明顯高于C組(P<0.05)，而B、C兩組間則差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

注：與C組比較，t分別為6.833、7.749、7.890，①P<0.05

2.23組人群ATP檢測結果A組與C組相比，僅在保存第7d時差異有統計學意義(P<0.05)，表現為A組的ATP含量低于C組；B、C兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。隨保存時間延長，A組的ATP含量變化表現為先增高后降低(P<0.05)，B、C兩組的ATP含量變化差異則無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.33組人群LDH檢測結果在整個保存過程中，隨保存時間延長，LDH均逐漸增多(P<0.05)；A、B組與C組LDH相比，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.43組人群葡萄糖檢測結果與C組比較，A組僅在第21d時葡萄糖濃度降低，差異有統計學意義(P<0.05)；B、C兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。隨保存時間延長，3組葡萄糖均逐步降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表2　3組人群ATP含量的變化情況Table 2　The change of ATP content in the 3 groups

注：與C組比較，t=-3.809,①P<0.05;與A組第1、7、21、35d比較，F=5.356,②均P<0.05

表3　3組人群LDH濃度變化情況Table 3　The change of LDH concentration in the 3 groups

表4　3組人群葡萄糖濃度的變化情況Table 4　The change of glucose concentration in the 3 groups

注：與C組比較,t為-2.443，①P<0.05；第1、7、21、35d比較, F分別為32.599、42.579、22.353，均P<0.05

3　討論

臨床應用成分輸血始于20世紀60年代，到20世紀80年代末各發達國家成分輸血比例均在95%以上[7]。懸浮紅細胞作為成分血一個主要的血液組分，在臨床上得到了廣泛的應用。現代醫療中, 臨床輸注全血或紅細胞的主要目的是增加患者循環血量, 提高血液攜氧能力[8]。但研究表明，血液在保存過程中, 紅細胞會發生一系列結構和功能的改變, 從而影響血液質量和臨床輸血效果[9]。近期研究表明，在儲存過程中，對血液新陳代謝指標更好的掌握，對于改善輸血策略非常重要，可能有助于臨床醫生在獲得對代謝的快速、有用的評估[10]。而無氧酵解相關指標反應的紅細胞能量代謝水平，可從一個方面分析紅細胞在體外保存中的質量。

ATP是無氧酵解的能源物質，是紅細胞內多種生化反應正常進行所必須的。多項研究表明 ，ATP對于維持紅細胞膜鈉泵的運轉，紅細胞內鈣環境的恒定，膜脂質的更新，紅細胞的正常形態和功能，延長紅細胞的保存期，以及提高輸注后紅細胞的存活率等均有舉足輕重的作用[11-13]，且當紅細胞 ATP 的含量<1.5μmol/L時，輸血后24h紅細胞的存活率顯著下降[14]。在本研究中，高原紅細胞增多組人群ATP較既往研究[7,9,11,15]不同之處在于，呈現出先上升后下降趨勢，而平原、高原健康組內人群均為逐漸下降。而高原紅細胞增多組較平原健康人群組僅在第7d時出現統計學差異。

LDH是參與無氧酵解過程中催化乳酸和丙酮酸之間氧化還原反應重要的酶類，提示無氧酵解的潛力[16-17]。本研究結果顯示，高原紅細胞增多人群、高原健康人群較平原健康人群在血液保存期間LDH變化均一致，表現為隨時間延長逐漸增加，但差異無統計學意義(P>0.05)，提示無氧酵解反應均逐漸增強。

葡萄糖為無氧酵解的底物，是提供紅細胞能量的主要來源。隨著保存時間延長，高原紅細胞增多組和平原健康人群組之間，僅在第21d時出現葡萄糖下降，差異存在統計學意義(P<0.05)。3組人群葡萄糖濃度總體呈現下降趨勢，提示紅細胞在離體過程中不斷消耗能量物質，以維持自身結構和功能。

4　結論

本研究結果表明，高原不同Hb水平人群與平原正常人群的懸浮紅細胞體外保存，3組人群的紅細胞無氧酵解相關指標無顯著性差異，大致符合既往研究[11-21]，反應了不同HB人群紅細胞無氧代謝水平的一致性，為高原紅細胞增多癥患者作為獻血者提供一部分依據，但尚需更大樣本量體外研究及臨床實驗進一步論證。