人心臟型脂肪酸結合蛋白檢測試劑盒的方法學評價及在急性冠狀動脈綜合征患者診斷中的臨床應用

劉亞巍，尚進，洛佳坤，蔣知新，彭旭東，衣志勇

(1.中央軍委聯(lián)合參謀部警衛(wèi)局保健處，北京 100017；2.中國人民解放軍醫(yī)學院、中國人民解放軍總醫(yī)院；3.中國人民解放軍第三○五醫(yī)院)

心肌生物標志物通常是心肌細胞內形成胞內結構的蛋白質組分。在外界各種理化因素的刺激下，心肌細胞有可能受到損傷，這些標志物可以由細胞釋放進入血液循環(huán)[1-3]。人心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)是心肌生物標志物的一種，它在人心肌細胞中的含量非常高，H-FABP是這些可溶性蛋白質的一種，論其含量，大概占到了4%～8%。H-FABP的分子量相對比較小，當心臟內的心肌細胞在外界理化生各種不良因素的刺激下，受到不同程度或輕或重的損傷的時候，心肌細胞的細胞膜的通透性必然會較前有所增加，H-FABP則可以穿過這樣的細胞膜，隨機地彌散到到胞外。因此，當心肌細胞受損時，H-FABP是最早由心肌細胞釋放而進入外周血液循環(huán)的生物標志物之一[4]。

H-FABP是一種非酶類的蛋白質，如果要想對其進行定量檢測，則需要使用免疫化學的相關測定方法，在眾多的免疫化學測定方法當中，被應用的最多的最廣泛的最普及的是抗原捕獲型酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA),也包括競爭性免疫分析法和免疫熒光測定法。在目前這些免疫化學的測定方法中，基本所有的方法都運用了單克隆抗體(MAb)。然而，這些檢測方法具有一個共同的缺點，就是耗時較長(至少需要45 min)，導致檢測結果的獲取速度過慢。

近來，本研究組聯(lián)合蘭州生物制品研究所根據(jù)《體外診斷試劑的臨床研究技術指導原則》[5]共同研發(fā)了H-FABP的 ELISA檢測試劑盒。本研究目的在于評估該ELISA試劑盒的檢測性能指標，以及臨床可接受性。

1　材料與方法

1.1主要材料

1.1.1 病例來源選擇從2010年3月至2016年3月期間，就診于中國人民解放軍總醫(yī)院并疑診急性冠狀動脈綜合征(ACS)而收入院治療的患者。納入標準：①具有胸痛、喘息、黑懵等ACS相關的臨床癥狀；②患者因相關不適就診于門急診，在接診醫(yī)生進行相關評估后，懷疑其診斷為ACS，從而進入相關科室進行治療；③從患者胸痛發(fā)作的那一刻開始計時，到患者進入相關科室進行治療，如果這個持續(xù)的時間小于12 h，那么該患者可以納入；④從患者發(fā)病的那一刻開始計時，到患者進行第一次抽血，如果這個持續(xù)的時間小于12 h，那么該患者可以納入。排除標準：如果患者有嚴重呼吸道相關、胃腸道相關、尿路相關、中樞以及外周神經(jīng)相關、全身血管內的血液相關疾病，或者在最近5年之內，患者曾經(jīng)患有屬于自身免疫系統(tǒng)相關的結締組織病、以及可能發(fā)生于全身各處的良性或惡性腫瘤等，或者在近2周以內，患者受到了重大的創(chuàng)傷，以及不慎獲得了感染性疾病。經(jīng)過篩選，共納入160例符合入選條件的患者。在相同的起止時間內，選取80例在中國人民解放軍第三○五醫(yī)院進行健康查體人員的相關信息。

1.1.2標本及采集被接診醫(yī)生懷疑是ACS的患者以及健康人群在到達醫(yī)院查體時，立即抽取3 mL外周靜脈全血。儲存外周血的裝置為肝素或分離膠真空采血管，將血漿或血清離心分離，轉速為3000 r/min。離心結束后將外周血保存于已經(jīng)購買并準備好的凍存管中，凍存管的容量為2 mL，再將凍存管保存到已經(jīng)購買好的冰箱內，并將溫度設置為-40 ℃。

1.1.3主要試劑與儀器使用的H-FABP檢測試劑盒(ELISA法)包括為蘭州生物制品研究所自主研發(fā)產(chǎn)品與荷蘭HBT公司已上市產(chǎn)品。Elecsys 2010全自動免疫分析儀為美國 Roche 公司產(chǎn)品，D×C 800型全自動生化分析儀為美國 Beckman coulter 公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1方法比較實驗從冰箱內拿出保存好的血漿樣本，將其放在室溫的環(huán)境中，隨著時間的推移，樣本會自動充分地混合，再使得該樣本平均分為2份，再拿出上文提到的國產(chǎn)和荷蘭兩種H-FABP檢測試劑盒，認真研讀各自的使用說明后，使用兩種試劑盒對上述已經(jīng)均分好的兩份樣本進行檢測，按照使用說明上的步驟計算出結果，再運用統(tǒng)計學原理，對結果進行相關性分析。

國產(chǎn)生物試劑盒測定H-FABP的操作步驟為：試劑盒內的試劑于2～8 ℃冰箱內保存，使用前從冰箱內取出，使其升至25 ℃的室溫。將試劑盒中配套的濃縮酶標洗滌液用去離子水稀釋備用，稀釋比為1∶20；血漿保存于-40 ℃，實驗前取出并平衡至室溫25 ℃。從試劑盒內拿出酶標洗液稀釋液，取出的體積為0.5 mL，再參照說明書內的步驟，取出一定量的參比品干粉，使用實驗室內制備好的去離子水對其進行溶解，接下來的重要步驟是對其進行稀釋，稀釋所采用的方法為對倍稀釋，最終本組得到了成倍稀釋好的參比品，他們的的終濃度依次為：50 μg/L、25 μg/L、12.5 μg/L、6.25 μg/L、3.125 μg/L、1.5625 μg/L、0.781 25 μg/L、0.390 625 μg/L；再拿出已經(jīng)購置好的移液槍，用其分別吸取樣本和已經(jīng)釋好的參比品，此時需要吸取的體積為100 μL，再利用移液槍將這兩種樣本共同放入反應孔里面。拿出封板膜將試管封好，使用振蕩器將試管內的液體混勻，再將其放進37 ℃的溫箱，進行30 min的孵育；孵育結束后用洗板機洗滌5次，將反應板放在吸水紙上拍干；再向每一個反應孔內加入100 μL的酶結合物，使用振蕩器將其混勻，再放進37 ℃的溫箱，進行30 min的孵育；利用洗板機將反應板進行5次洗滌，將反應板放在吸水紙上拍干；向每個反應孔中先后加入底物A、B液，用振蕩器混勻后置于37 ℃溫箱，進行20 min的孵育；到時間后，向每個反應孔中加入50 μL的終止液，利用振蕩器將其混勻；將反應板放入酶標儀內，測定每個反應孔在450 nm入射光下的吸光度值。利用CurveExpert、EXCEL軟件繪制標準曲線，求出樣本濃度。

荷蘭HBT公司試劑盒測定H-FABP的操作步驟為：實驗開始前從2～8℃的冰箱內取出試劑，使其升至25 ℃的室溫。拿出試劑盒內的配套濃縮洗滌液，按照1∶20的比例對配套濃縮液進行稀釋，對于已經(jīng)稀釋好的洗滌液，需要對其妥善保存，日后使用時會非常的方便快捷；需要繼續(xù)取出試劑盒中的濃縮樣本稀釋液，接下來的重要步驟是對其進行稀釋，需要注意的是稀釋的比例為1∶10，類似的需要對其妥善保存，日后使用時會非常的方便快捷；此時需要繼續(xù)拿出試劑盒內的濃縮酶標二抗，使用去離子水對其按照1∶5的比例進行稀釋；之前已經(jīng)收集好的血漿樣本保存于-40 ℃的冰箱內，在實驗的這一步，此時需要將其取出，放在室溫25 ℃的環(huán)境下。繼續(xù)取出試劑盒內的樣本稀釋液，下面的重要步驟是對標準品進行稀釋，稀釋的過程需要一直持續(xù)多次，經(jīng)過稀釋后的標準品的終濃度分別為：25 000 ng/L、10 000 ng/L、4000 ng/L、1600 ng/L、640 ng/L、256 ng/L、102 ng/L、0 ng/L。后面添加二抗、顯色、孵育、測定等步驟參照蘭州試劑盒步驟。

1.2.2精密度實驗先從冰箱中取出保存?zhèn)溆玫?份標本，這3份標本的濃度各有不同，可以認為是高、中、低3個濃度，再拿出蘭州H-FABP試劑盒，下面的重要步驟是連續(xù)檢測，檢測對象是上述3個標本，檢測次數(shù)為20次，得到檢測的結果以后，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計方面需要的是H-FABP的平均值，還有方差，有了這兩個數(shù)據(jù)，進而求出批內變異系數(shù)，這里提供公式：變異系數(shù)(CV)=方差/平均值×100%。從冰箱中取出保存?zhèn)溆玫?份標本，這3份標本的濃度各有不同，可以認為是高、中、低3個濃度。重要步驟是使用國產(chǎn)試劑盒連續(xù)檢測，檢測對象是上述3個標本，檢測方式為每天檢測1次，連續(xù)20 d，同理得到檢測的結果以后，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計方面需要的是H-FABP的平均值，還有方差，有了這兩個數(shù)據(jù)，進而求出批間變異系數(shù)。

1.2.3回收實驗先從冰箱中拿出保存?zhèn)溆玫?份血漿，從中取出一定量的體積，這里實驗中所需要的體積為0.9 mL，再嚴格遵照隨機的原則，從這5份血漿中選出4份，分別加入H-FABP的標準液，所加的標準液的體積為0.1 mL，而需要的濃度要特別注意保持正確，分別為50 μg/L、25 μg/L、12.5 μg/L、6.25 μg/L，而剛才經(jīng)過挑選被剩下的那一份標本，根據(jù)實驗對照的原則，需要做的是向其中加入一定量的0.9%氯化鈉注射溶液，這里的一定量指的是0.1 mL，這樣操作之后的這份標本就被認定為對照組。下面的重要步驟是混勻，混勻的對象是上述的經(jīng)過配置操作后的所有的5份標本，拿出國產(chǎn)H-FABP試劑盒進行檢測，檢測對象為剛才提到的5份標本，檢測的方式為連續(xù)10次檢測，注意這里使用的試劑盒是要求型號相同的，得到檢測的結果以后，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計方面需要的是平均，進而求得回收率，這里提供了公式：回收率=(加入標準液的血漿測定值-加入0.9%氯化鈉注射溶液的血漿測定值)/加入量×100%。

1.2.4干擾實驗

1.2.4.1血紅蛋白液本研究所使用的血紅蛋白液是自行制備。制備的方法是機械溶血，然后再利用美國貝克曼庫爾特ACT5DIFCP。接下來的重要步驟是檢測濃度，血紅蛋白液檢測的濃度為160 g/L；膽紅素濃縮液：本研究中使用的膽紅素濃縮液是本組購買膽紅素干粉，對干粉進行溶解，再參照本研究上述步驟中提到的方法，對其進行稀釋則可。然后本組再利用美國貝克曼庫爾特D×C 800儀檢測膽紅素濃縮液，檢測的濃度為845 μmol/L；脂肪乳注射液(20%)：本研究中使用美國貝克曼庫爾特D×C 800儀檢測所購買的脂肪乳注射液濃度，檢測的濃度為488 mmol/L。

1.2.4.2試驗組內的樣本本研究中的樣本使用的是肝素抗凝血漿，來源于高齡健康志愿者(正常)和患者(異常)，使用0.9%氯化鈉注射溶液配制干擾物，使它們的濃度各自不會相同。接下來的重要步驟是混合，這里混合的對象為上述的樣本和試驗全血，本研究將比例設置為1∶9，得到血漿樣本。而其中的溶血血紅蛋白的濃度按照本研究要求被控制為16 g/L、15 g/L 、14 g/L 、13 g/L 和12 g/L，總膽紅素(TBIL)被嚴格控制為84.5 μmol/L、42.3 μmol/L、21.2 μmol/L、10.6 μmol/L 和5.3 μmol/L，三酰甘油(TG)被嚴格控制為48.8 mmol/L、16.3 mmol/L、5.4 mmol/L、1.89 mmol/L和0.6 mmol/L。再按1∶9的比例將0.9%氯化鈉注射溶液加入正常和異常血漿中混合均勻作為對照組。

1.2.4.3影響度的計算采用蘭州生物制品研究所研制的H-FABP試劑盒測定對照血漿和加入干擾物的血漿(試驗組)中的H-FABP濃度各2次。得到檢測的結果以后，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計方面取平均值，進而求得影響度。關于計算影響度的方法，本研究首先需要選定一個標準，這里以對照組的測定值作為標準，按照上文提到的設計，沒有加入干擾物質的血漿可以作為對照組，由此進一步求出影響度(%)。影響度=(加入干擾物的血漿測定值-未加入干擾物的血漿測定值)/未加入干擾物的血漿測定值×100%。

2　結果

2.1方法比較實驗經(jīng)過上述步驟以后，本研究得到了240份標本的檢測結果。進行相關性分析顯示，國產(chǎn)試劑盒(Y)與荷蘭試劑盒(X)檢測的H-FABP值之間的回歸方程為：Y=2.5943X+3.2238，R2=0.9252，相關系數(shù)R=0.96，P<0.001(見圖1)。

圖1　國產(chǎn)試劑盒與荷蘭試劑盒測定血H-FABP值的

2.2精密度實驗國產(chǎn)試劑盒檢測H-FABP的批內變異系數(shù)(CV)：低值為6.4%，中值為8.2%，高值為5.7%(見表1)；批間CV：低值4.1%，中值為3.9%，高值為4.1%(見表2)。以上這些經(jīng)過充分計算的結果都充分說明了國產(chǎn)試劑盒檢測H-FABP的重復性是非常好的。

表1　國產(chǎn)試劑盒檢測H-FABP的批內精密度實驗結果

注：H-FABP為心臟型脂肪酸結合蛋白，CV為變異系數(shù)，下表同

表2　國產(chǎn)試劑盒檢測H-FABP的批間精密度實驗結果

2.3回收實驗當H-FABP標準溶液的濃度各有不同時，各自濃度所對應的回收率的范圍是93.0%～105.7%(見表3),說明國產(chǎn)試劑盒檢測H-FABP的準確度良好。

表3　國產(chǎn)試劑盒檢測H-FABP的回收實驗結果

2.4干擾實驗

2.4.1TBIL對H-FABP的干擾實驗當TBIL的濃度各有不同時，各自濃度對正常水平的H-FABP的影響度的范圍是-9.57%～2.39%(見表4)；當TBIL的濃度各有不同時，各自濃度對異常水平的H-FABP的影響度的范圍是-20.71%～7.43%(見表5)。說明當TBIL的濃度較高對H-FABP的檢測有一定影響。

表4　TBIL對正常水平H-FABP的影響

注：TBIL為總膽紅素，下表同；H-FABP對照值為2.09 μg/L

表5　TBIL對異常水平H-FABP的影響

注：H-FABP對照值為98.64 μg/L

2.4.2TG對H-FABP的干擾實驗當TG的濃度各有不同時，各自的濃度對正常水平的H-FABP的影響度得范圍是-6.66%～10.13%(見表6)。當TG的濃度各有不同時，各自的濃度對異常水平的H-FABP的影響度的范圍是5.07%～10.93%(見表7)。

表6　TG對正常水平H-FABP的影響

注：TG為三酰甘油，下表同；H-FABP對照值為1.49 μg/L

表7　TG對異常水平H-FABP的影響

注：H-FABP對照值為91.53 μg/L

2.4.3溶血血紅蛋白對H-FABP的干擾實驗當溶血血紅蛋白的濃度各有不同時，各自的濃度對正常水平的H-FABP的影響度的范圍是-9.18%～8.16%(見表8)。當溶血血紅蛋白的濃度各有不同時，各自的濃度對異常水平的H-FABP的影響度的范圍是-9.27%～9.83%(見表9)。

表8　溶血血紅蛋白對正常水平H-FABP的影響

注：H-FABP對照值為0.98 μg/L

表9　溶血血紅蛋白對異常水平H-FABP的影響

注：H-FABP對照值為96.70 μg/L

3　討論

H-FABP的臨床檢測水平近些年有了巨大的進步，檢測的速度、效率和靈敏度自然也會跟隨著技術進步而提高[7]。目前檢測技術比較成熟的是雙抗體夾心ELISA方法。本組在2004年初步地探討了H-FABP在正常人體內的參考值范圍，利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對126例健康人群的血清H-FABP數(shù)值進行了測定，而且，本研究團隊在進行測定工作的同時，挑選了三種心肌標志物作為實驗的對照，這三種標志物是心肌肌酸激酶同工酶(CK-MB)、血漿肌鈣蛋白I(cTnI)、血漿肌紅蛋白(Myo)。經(jīng)過一系列的實驗之后，得出H-FABP在正常人體內的血清濃度的范圍為(3.79±3.52)μg/L，而且，這個數(shù)據(jù)的范圍不隨著人的性別和年齡的不同而變化。我國居民血清H-FABP正常參考值范圍為 0～10.83 μg/L[8]。相比于在臨床上已廣泛使用、檢測水平獲得業(yè)內認可的荷蘭試劑盒，本研究使用的蘭州生物制品研究所研發(fā)的檢測試劑盒成本十分低廉，是荷蘭試劑盒檢測成本的五分之一。

在精密檢測的業(yè)界內，大型精密檢測儀器是一項重要的內容。精密度是在規(guī)定的條件下獲得的獨立測定結果之間的接近程度，亦定義為是測定值與平均值之間的符合程度，它可以表示重復測定值之間的一致性，是反映隨機誤差的一個參數(shù)之一。精密度分為批內精密度與批間精密度。CV反映了精密度的好壞，CV數(shù)值越小，精密度越好，反之則越差。CV包括：批內CV、批間CV，它的含義是整個分析體系的可重復程度[9]。美國化學發(fā)光免疫分析法臨床檢驗室內質量控制文件(CLIA′88)中規(guī)定的CV的指標為10%。在差不多30年以前，CLIA非常特別且專門地針對大型精密儀器制定了一系列的文件，其中一份文件的名字叫做EP5-A2，文件規(guī)定：批內CV和批間CV分別應為CLIA指標的1/4和1/3[10]。本研究顯示，國產(chǎn)試劑盒和荷蘭試劑盒的檢測結果存在一些差異，但仍保持有良好的相關性(R=0.96)。精密度實驗和回收率實驗的結果說明了國產(chǎn)試劑盒檢測H-FABP在穩(wěn)定性和準確度方面十分的優(yōu)秀。對于干擾試驗來說，本研究顯示，當總膽紅素、三酰甘油和溶血血紅蛋白的血清濃度達到比較高的水平時，對測定結果可以產(chǎn)生直接的影響，對正常值尤其如此。

本研究顯示，就檢測相關性來說，蘭州生物研究所生產(chǎn)的H-FABP檢測試劑盒與荷蘭HBT公司生產(chǎn)的H-FABP檢測試劑盒具有非常好的檢測相關性，國產(chǎn)試劑盒具有價格低廉、檢測快速等優(yōu)勢，擁有巨大的潛在臨床應用價值。