體外擴增的自然殺傷細胞特點及其殺傷活性研究

陳穩，毛菊，楊雯雯，胡世蓮，程民

[中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)，安徽省老年醫學研究所，腫瘤免疫與營養治療安徽省重點實驗室,合肥 230001]

腫瘤細胞免疫治療技術作為一種新興的腫瘤治療手段，具有殺瘤識別譜廣、抗癌殺傷力高、毒副作用小等特點。自然殺傷細胞(NK)通過自身表面活化性受體與腫瘤細胞表面配體之間的作用，可不受MHC分子的限制，進而識別MHC-I類分子表達下調或缺失的腫瘤細胞并發揮殺傷功能。由于NK細胞在外周血中占有較小的比例，占淋巴細胞的5%～15%，并且腫瘤患者體內NK細胞的功能存在不同程度的缺失，難以產生良好抗腫瘤效果，需要通過體外培養增加NK細胞的數量和改善NK細胞的功能[1-2]。因此，通過有效的體外擴增，獲得足夠數量、高純度、高抗腫瘤活性并可用于臨床治療的NK細胞具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1外周血單個核細胞分離與培養試劑本研究共收集10份健康志愿者外周血標本，50 毫升/份，EDTA抗凝，無菌采集。淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，NK細胞體外擴增試劑盒購自杭州中贏生物醫療科技有限公司，GT-T551 H3培養基購自寶日醫生物技術(北京)有限公司，重組人白細胞介素-2購自上海華新生物高科技有限公司，硫酸慶大霉素注射液購自福建匯天生物藥業有限公司。所有健康志愿者均簽署知情同意書，研究方案經中國科學技術大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準。

1.1.2細胞株及培養基SK-MES-1細胞、A549細胞、HepG2細胞、K562細胞購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)，Ho8910細胞購自中科院上海細胞庫。RPMI 1640、DMEM液體培養基、胎牛血清、胰蛋白酶溶液等購自HyClone公司。

1.1.3熒光抗體等Anti-CD16 (FITC)、anti-CD8 (PE)、anti-CD3 (PerCP-Cy5.5)、anti-CD56 (APC)抗體、同種型抗體購自BD公司，Mouse IgG購自Biodesign公司，PBS磷酸鹽緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.4細胞毒活性檢測試劑CellTrace Far Red試劑盒購自Invitrogen公司，TritonX-100購自Sigma公司。

1.1.5外源性因子檢測試劑硫乙醇酸鹽流體培養基、胰酪大豆胨液體培養基、精氨酸支原體肉湯培養基、支原體瓊脂培養基、支原體半流體培養基購自中國食品藥品檢定研究院，人類免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒檢測試劑盒等購自達安基因股份有限公司。

1.2方法

1.2.1外周血單個核細胞分離與擴增采用密度梯度離心法分離獲取外周血單個核細胞，使用30 mL NK細胞培養液(GT-T551 H3培養基+200 IU/mL IL-2 +1.0% 自體血漿+80 u/mL慶大霉素)重懸細胞沉淀，加入試劑A1，置于75 cm2培養瓶中，37 ℃、5.0% CO2、飽和濕度培養，期間添加培養液。第8天，向細胞培養液中加入試劑A2，繼續培養，期間根據細胞生長情況添加NK細胞培養液。

1.2.2細胞表型檢測將待檢測細胞重懸為單細胞懸液，1×106個/管，每管加入0.1 μg/μL mIgG溶液2.0 μL，室溫15 min；加入CD3、CD56等熒光抗體，4 ℃，避光標記30 min；加入1×PBS溶液洗滌細胞(3500 r/min，4 ℃，5 min)，棄上清；使用300 μL 1×PBS溶液重懸細胞，上機檢測。

1.2.3細胞毒活性檢測使用紅色熒光染料標記靶細胞，37 ℃，避光孵育20 min，洗滌細胞3次(3000 r/min，25 ℃，10 min)，調整細胞濃度為1×105/mL，在無菌FACs管中加入標記的靶細胞，每管加100 μL。根據效應細胞與靶細胞的比例調整效應細胞(NK細胞)的濃度，并向各管中加入NK細胞懸液，100 微升/孔。每個實驗設置4個重復。37 ℃，5.0%二氧化碳，培養4 h。FACs儀檢測靶細胞的熒光強度，區分熒光陽性/陰性的靶細胞。計算殺傷活性。

1.2.4外源性因子檢測參照2015年版《中國藥典》，檢測培養21 d后NK細胞及培養上清中細菌、病毒、支原體等。

2　結果

2.1體外擴增的NK細胞生長情況將分離得到的外周血單個核細胞分別接種至NK細胞培養液中，37 °C，5% CO2培養，根據細胞生長情況補充NK細胞培養液，期間進行細胞計數，繪制生長曲線。結果表明，NK細胞呈懸浮狀態生長，有成團細胞，細胞狀態及折光性好(圖1A)，臺盼蘭染色著色細胞小于10%，接種7 d后NK細胞出現快速增殖，培養至21 d左右細胞增殖速度減慢，擴增倍數在500倍以上，總數超過1×1010個(圖1B)，細胞數量可以滿足臨床輸注要求。

2.2體外擴增的NK細胞表型及細胞毒活性利用流式細胞術檢測體外培養不同時間后NK細胞表面CD3及CD56等分子的表達情況，隨著培養天數的增加，CD3-CD56+NK細胞比例不斷升高，21 d后，CD3-CD56+NK細胞占所有細胞的90%以上(93.2%±2.30%)(圖2A，圖2C)。殺傷實驗結果如圖2B所示，培養21 d后NK細胞對SK-MES-1、A549、HepG2、K562及Ho8910等細胞均有不同程度的殺傷活性，在效/靶比為50∶1時，NK細胞對A549細胞、K562細胞和Ho8910細胞的殺傷效率在60%以上；對HepG2細胞和SK-MES-1細胞的殺傷效率在45%以上。

圖1　體外培養的NK細胞形態及生長曲線(n=10)　A示NK細胞呈懸浮狀態生長，有成團細胞，細胞狀態及折光性好(×100);B示臺盼蘭染色著色細胞小于10%，接種7 d后NK細胞出現快速增殖，培養至21 d左右細胞增殖速度減慢

圖2　體外擴增的NK細胞純度及其細胞毒活性　A示培養不同天數NK細胞純度變化情況；B示培養21 d后NK細胞殺傷能力；C示培養21 d后NK細胞比例

2.3外源性因子檢測結果

2.3.1細菌、真菌檢測取體外擴增21 d后NK細胞培養上清。經過14 d培養后，胰酪大豆胨液體培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基中均無真菌或細菌生長，結果表明，NK細胞不存在細菌及真菌污染。

2.3.2支原體檢查取體外擴增21 d后NK細胞培養上清分別接種于不同支原體培養基中，21 d后，各接種管中均無支原體或其他異物生長，結果表明NK細胞中不存在上述培養基所能培養的支原體污染。

2.3.3病毒因子檢測使用乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、丙型肝炎病毒及人巨細胞病毒檢測試劑盒檢測培養21 d后的NK細胞及其培養上清，檢測結果均為陰性。

3　討論

人外周血NK細胞占總淋巴細胞的5%～15%，表型為CD3-CD56+，NK 細胞發揮殺傷活性時無MHC限制性，亦不需要特異性抗原的刺激，在機體抗腫瘤免疫中扮演重要的角色。同時，NK細胞與機體其他多種免疫細胞相互作用，發揮免疫調節功能，調節機體的免疫狀態[3-4]。NK細胞的殺傷特性及其免疫調節功能使其成為腫瘤免疫治療強有力的工具，自體NK細胞輸注用于腫瘤臨床治療已有三十幾年的歷史，但臨床治療效果并不理想[5-6]。近年來，供者來源(同種異體)的 NK細胞用于腫瘤治療已引起了人們的重視，并對多種惡性腫瘤具有較好的治療效果[7-10]。由于腫瘤患者體內NK細胞的數量和功能均存在一定程度的缺陷，不足以有效的發揮抗腫瘤功能，體外擴增是有效的增加NK細胞數量、改善NK細胞功能的手段，但不同的培養方法對NK細胞的功能和活性影響較大，使用有效的NK細胞體外擴增方法，獲得足夠數量、高純度、高殺瘤活性的NK細胞，并將其用于腫瘤患者的臨床治療具有重要意義[11-13]。

本研究利用人NK細胞體外擴增試劑盒對外周血單個核細胞進行刺激和培養，建立了有效的NK細胞擴增方法，體外培養16～21 d后，NK細胞純度(CD3-CD56+細胞比例)及活率均在90%以上，總數在1×1010以上，可以滿足腫瘤患者臨床輸注的需要。培養過程中所用的NK細胞培養液為無血清培養基，不含動物血清，可以避免異種血清來源的微生物污染。培養21 d后的NK細胞對A549細胞、K562細胞和Ho8910細胞的殺傷活性較強，對HepG2細胞和SK-MES-1細胞也具有較強的殺傷活性。同時，體外培養21 d后，NK細胞及其上清液中均未檢測到細菌、真菌、支原體及病毒因子等，上述結果為NK細胞的臨床提供了重要的依據。

綜上所述，本研究所建立的NK細胞體外擴增方法具有細胞生長速度快、數量多、純度高、對腫瘤細胞的殺傷力強等特點。供者來源的50 mL外周血分離得到的單個核細胞，經體外培養16～21 d后，CD3-CD56+NK細胞數量、純度及活率等均可滿足臨床治療的需要，NK細胞對多種腫瘤細胞具有較強的殺傷活性，同時不存在細菌、真菌、支原體及病毒等的污染，具有很好的臨床應用前景。