胃癌患者血漿miRNA-21的表達水平及意義

姜 雷 代 強 梁曉磊 關泉林 趙 鵬 汪曉煒

(蘭州大學第一醫院腫瘤外科，甘肅 蘭州 730000)

胃癌已成為一類嚴重危害我國人民健康的疾病〔1〕。胃癌的發病原因尚未完全明了，多數學者認為是環境與基因交互作用的結果。miRNA是一類分布廣泛的小的非編碼蛋白質的RNAs，其功能是調控基因表達，在腫瘤中發揮著相當于癌基因或抑癌基因的作用，調節著腫瘤細胞的多種重要生物學行為〔2〕。研究表明miRNA-21在胃癌患者的組織中高表達〔3〕，現有研究已證實外周血和組織來源的miRNA的表達譜是一樣的，提示檢測血漿中的miRNA有望成為診斷和判斷惡性腫瘤預后的非損傷性分子標志物〔4〕。本研究將采用qRT-PCR的方法檢測胃癌患者和健康人群血漿中miRNA-21的表達量，探討其表達量與胃癌臨床病理特征的相關性及診斷胃癌的準確性。

1 資料與方法

1.1病例及標本 收集蘭州大學第一醫院腫瘤外科2014年6月至2015年6月期間胃癌患者的血漿標本共59例，同時收集44例健康對照者血漿標本。所有胃癌病例均有詳細的臨床病理資料，所有標本經病理學檢查明確診斷為胃癌。所有的胃癌患者手術前未接受化療、放療、生物治療等其他治療。胃癌患者和健康對照人群在年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。血漿標本制作流程：抽取外周血5 ml置于含EDTA 抗凝的取血管中，靜置30 min，4℃下1 300 r/min離心15 min，取上層澄清血漿至另一RNAse-free Eppendorf管，10 000 r/min 離心15 min 后取上層血漿每300 μl 分裝至RNAse-free Eppendorf 管，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，同時收集患者的臨床病理資料。

1.2實驗方法 采用Trizol (Invitrogen)提取胃癌患者血漿中的總RNA。采用天根FastQuant RT Kit逆轉錄，qRT-PCR法定量miRNA-21，以U6 miRNA作為對照。miRNA-21引物：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；U6引物：CTCGCTTCGGCAGCACA。使用miRcute 增強型miRNA 熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)和其通用反向引物。各樣本的△Ct 值=(目的基因 Ct值-內參基因Ct值)，以U6為內參基因，各樣本基因表達相對定量值為2-△Ct。

1.3統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行配對t檢驗，相關性采用Wilcoxon 秩和檢驗。

2 結 果

2.1miRNA-21在胃癌患者及健康對照者血漿中的表達量 miRNA-21在胃癌患者血漿中的相對表達量為30.041±4.214，明顯高于健康對照者(27.993±4.488，P=0.014)。

2.2miRNA-21血漿表達水平與胃癌患者臨床病理特征的相關性 胃癌患者miRNA-21血漿表達水平與胃癌患者的性別(P=0.437)、年齡(P=0.982)、分化程度(P=0.082)、TNM分期(P=0.402)、浸潤深度(P=0.658)及腫瘤大小(P=0.255)無明顯的相關性；而與淋巴結轉移明顯相關(P=0.010)。見表1。

2.3血漿miRNA-21的表達水平診斷胃癌的準確性 曲線下的面積(AUC)=0.641，95%CI(0.531～0.751)，敏感度為52.5%，特異度為75%，提示血漿miRNA-21的表達水平診斷胃癌具有較好的準確性，見圖1。

表1 miRNA-21的表達水平與胃癌患者臨床病理特征的相關性

圖1 血漿miRNA-21的表達水平診斷胃癌的準確性

3 討 論

miRNA-21是一種與惡性腫瘤相關的miRNAs，主要參與基因的表達調控，是唯一在所有惡性腫瘤均高表達的miRNAs〔5〕。但是既往研究對胃癌miRNA-21的研究主要集中在腫瘤組織或腫瘤細胞，組織活檢或是切片屬于創傷性檢查，而血液標本采集為非創傷性檢查手段，更符合機體的生理病理狀況，有助于動態監測機體的病情變化。外周血miRNA的表達譜可構成識別癌癥與其他疾病的“指紋”，可用于腫瘤的篩查診斷、分型分類、療效預測及預后判斷等領域〔6〕。本研究表明胃癌患者血漿中miRNA-21的表達量高于健康人群，用于胃癌的早期診斷。加之血漿中的miRNA還非常穩定，檢測方法簡單、定量準確、標本采集方便、檢測成本低廉，有很大的臨床應用前景。

Zhang等〔7〕用實時定量PCR 方法證實了miRNA-21 在人胃癌組織及細胞株中顯著高表達，miRNA-21高表達會顯著增強胃癌細胞的增殖和侵襲能力，而敲除miRNA-21會導致細胞凋亡顯著增加，增殖、侵襲和遷移能力會明顯下降，RECK基因可能是miRNA-21基因的作用靶點，體外實驗還發現抑制miRNA-21的表達可以增加抑癌基因PTEN的表達，降低腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲能力，而增強miRNA-21的表達則產生相反的效果〔8〕，而且PTEN mRNA的3′-UTR區存在miRNA-21的直接結合位點，miRNA-21通過與之結合，在轉錄后水平調節PTEN的表達，參與多種疾病的發生發展〔9〕。一項動物實驗探討了miRNA-21在淋巴瘤發生中的作用，發現miRNA-21高表達的小鼠約半數3個月后表現出淋巴瘤的特征，對照組卻沒有此現象，當降低miRNA-21的表達水平后，表現為淋巴瘤的小鼠腫瘤逐漸退化，仍然存活了3個月，該試驗表明miRNA-21在腫瘤的發生、發展中發揮著重要的作用，提示抑制miRNA-21可能會成為腫瘤治療的一種新方法〔10〕。

有研究表明miRNA-21還可能是預測惡性腫瘤患者生存時間的分子標志物，通過檢測舌鱗狀細胞癌患者miRNA-21的表達與臨床特征的關系，發現高表達的miRNA-21意味著不良預后〔11〕。Gao等〔12〕學者的研究也表明：血漿和組織中miRNA-21的表達水平可以預測肺癌輔助化療的療效，miRNA-21還可以用來預測該類患者的無疾病復發生存時間。Jiang等〔13〕學者的研究也表明miRNA-21還可能是預測晚期胃癌患者預后較好的分子標記物，miRNA-21表達水平較低的患者往往總生存時間較長。本研究表達血漿miRNA-21的高表達，與淋巴結的轉移相關。Motoyama等〔14〕對49例胃癌患者的腫瘤組織檢測發現 miRNA-21的表達與腫瘤大小和浸潤深度相關，而Wu等〔15〕的研究卻表明miRNA-21 的表達水平與胃癌患者的臨床病理分期、淋巴結轉移、分化程度無相關性。因此血漿 miR-21 的表達水平與胃癌患者臨床病理特征之間的相關性尚待大樣本的臨床研究進一步證實。Tsujiura等〔16〕研究結果顯示：miRNA-21的表達量診斷胃癌的敏感度為60.9%，特異度為63.3%，AUC為0.673；一篇meta分析也定量評價了miRNA-21的表達水平診斷胃癌的準確性，該研究共納入了5篇病例對照試驗，meta分析合并后結果顯示，miRNA-21的表達量診斷胃癌的敏感度為66.5%，特異度為83.1%〔17〕；Wu等〔15〕學者比較了miRNA-21、CA199和CEA診斷胃癌的準確度，結果提示三種分子標志物診斷胃癌的敏感度和特異度分別為：81.3%、73.4%，60.5%、55.9%，68.6%、59.3%，miRNA-21的準確度似乎要優于傳統的腫瘤標記物，提示miRNA-21可能會成為潛在的診斷胃癌新型分子標志物?？傊?，miRNA-21 在胃癌患者的血漿中表達顯著上調，可能與胃癌患者的臨床病理特征指標相關，參與了胃癌的發生發展過程，有望成為潛在的腫瘤標志物和治療靶點。

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