姜黃素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞Caco2中MACC-1及PGE2的影響

賈 佳 趙 逵 陳 濤

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 470000)

姜黃素及其衍生物的抗腫瘤作用發(fā)展前景無(wú)限。結(jié)腸癌是我國(guó)的常見(jiàn)的消化道腫瘤之一。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子(MACC-1)是一個(gè)新的癌基因，通過(guò)全基因細(xì)胞分析被Stein等〔1〕研究者發(fā)現(xiàn)，在胃癌〔2〕、肝癌〔3〕、胰腺癌〔4〕、子宮內(nèi)膜癌〔5〕、食管癌〔6〕等的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移起到至關(guān)重要的作用。MACC-1是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)激活配體的原癌基因，并且能夠調(diào)控HGF受體(c-Met)所介導(dǎo)的信號(hào)通路成為該通路的關(guān)鍵調(diào)控因素。前列腺素(PG)E2，是花生四烯酸轉(zhuǎn)化的生物活性物質(zhì)，在許多腫瘤的原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)，尤其在結(jié)腸癌中表達(dá)更為突出。本實(shí)驗(yàn)研究姜黃素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞Caco2增殖及對(duì)MACC-1及PGE2蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1藥物和試劑 姜黃素、MTT(Sigma公司)；胎牛血清、改良型1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Hylone公司)；DMSO(貴陽(yáng)恒因生物)；兔抗人多克隆MACC-1(Abcam公司)，β-actin引物、大鼠抗人多克隆c-Met抗體(Santa Cruz 公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、辣根酶標(biāo)記鼠抗兔IgG(H+L) (北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；β-actin多克隆抗體(小鼠來(lái)源)、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L) (北京中杉金橋公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco2購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所，細(xì)胞培養(yǎng)：結(jié)腸癌細(xì)胞Caco2，接種于含10%胎牛血清改良型1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2MTT法檢測(cè)姜黃素對(duì)Caco2細(xì)胞增殖的抑制 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco2 細(xì)胞，設(shè)空白組、對(duì)照組、姜黃素組，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×106個(gè)/ml，接種于96孔板中，分別加入5、10、20、40、60、80、100、120 μmol/L，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μl 0.5%的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀讀取A490 值，計(jì)算出半數(shù)致死量(IC50)。

1.2.3ELISA檢測(cè)PGE2 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按5×104個(gè)/孔，每孔500 μl培養(yǎng)液，分別接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h貼壁后，加入 48 μmol/L姜黃素，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)對(duì)照組，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于6、12、24、48 h取上清入滅菌過(guò)的EP管中，取上清液100 μl/孔按ELISA試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品設(shè)復(fù)孔。

1.2.4Western印跡法檢測(cè)Caco2細(xì)胞中c-Met與MACC-1 蛋白的表達(dá) 用48 μmol/L姜黃素處理Caco2細(xì)胞，培養(yǎng)6、12、24和48 h，并設(shè)陰性對(duì)照，提取總蛋白后，再用BCA定量試劑盒進(jìn)行總蛋白定量，樣品20 μl上樣，加入緩沖液電泳，轉(zhuǎn)膜，再封閉，加一抗雜交(c-Met與MACC-1、β-actin)及相應(yīng)二抗，暗盒中曝光后進(jìn)行顯影和定影，用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同藥物濃度對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco2增殖的影響 同對(duì)照組比較，隨著姜黃素濃度增加，OD值隨之顯著降低，存在量效關(guān)系(P<0.05)，并測(cè)得姜黃素對(duì)Caco2細(xì)胞的IC50為49.5 μmol/L，見(jiàn)圖1。

2.2不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞上清液PGE2水平 對(duì)照組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，上清液中PGE2水平不斷增加，加入48 μmol/L姜黃素干預(yù)后，上清液中PGE2水平明顯下降，與同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

圖1 不同濃度姜黃素對(duì)Caco2細(xì)胞48 h生長(zhǎng)增殖的影響

組別6 h12 h24 h對(duì)照組61.934 9285.391 08170.117 60姜黃素組23.283 201)31.338 851)45.178 651)

與同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.3姜黃素對(duì)Caco2細(xì)胞中c-Met與MACC-1蛋白表達(dá)的影響 姜黃素濃度48 μmol/L干預(yù)Caco2細(xì)胞6、12、24和48 h時(shí)c-Met與MACC-1蛋白均較對(duì)照組表達(dá)逐漸降低(圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表2。

圖2 姜黃素對(duì)Caco2細(xì)胞中MACC-1及c-Met蛋白表達(dá)的影響

組別MACC-1c-Met對(duì)照組0.924 0±0.147 70.714±0.065姜黃素6 h組0.686 8±0.111 51)0.614±0.0551)姜黃素12 h組0.476 3±0.171 51)0.584±0.0351)姜黃素24 h組0.281 8±0.130 81)0.367±0.0351)姜黃素48 h組0.092 0±0.044 72)0.125±0.0352)

與同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

姜黃素聯(lián)合維生素C，對(duì)胃腫瘤細(xì)胞SGC-7901周期 有明顯的抑制作用〔7〕。張建中等〔8〕研究顯示姜黃素對(duì)胃腫瘤細(xì)胞SGC-7901的抑制作用可能是通過(guò)抑制IKK途徑降低IκBα的降解從而抑制核因子(NF)-κB通路的激活。化療藥物能夠殺滅腫瘤，但對(duì)正常的細(xì)胞也具有殺傷作用，所以在抗腫瘤的治療中盡量減少化療藥物的用量。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，姜黃素能夠抑制體外結(jié)腸癌Caco2細(xì)胞的增殖，呈劑量依賴性，隨著劑量的增加，腫瘤細(xì)胞明顯被抑制。PGE2 能促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化，也能促進(jìn)腫瘤血管的形成，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制有免疫調(diào)節(jié)功能的淋巴因子產(chǎn)生，抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖、腫瘤壞死因子(TNF)的產(chǎn)生；可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(IL)-10產(chǎn)生〔9～11〕。因此，應(yīng)用環(huán)氧化酶抑制劑姜黃素可減輕腫瘤引起的免疫抑制作用及PGE2蛋白表達(dá)的下降，說(shuō)明姜黃素有可能抑制了TNF-α，這與相關(guān)研究〔12〕結(jié)果一致，PGE2對(duì)腫瘤壞死因子具有抑制作用。PGE2是脂質(zhì)信號(hào)分子發(fā)揮著各種功能，如發(fā)熱、血管擴(kuò)張、子宮收縮、刺激成骨細(xì)胞的吸收等一系列作用，研究顯示〔13〕15-羥基前列腺素脫氫酶(15-PDGH)是PGE2生物活性氧化酶，能夠綁定PG因子，促進(jìn)造血干細(xì)胞的改善、炎癥恢復(fù)。研究顯示〔14〕在結(jié)腸癌LOVO中，PGE2能上調(diào)β-catenin和VEGF的蛋白表達(dá)，從而激活wnt信號(hào)通路，而PGE2抑制wnt/β-catenin時(shí)，VEGF的表達(dá)無(wú)異常，說(shuō)明PGE2對(duì)VEGF的調(diào)節(jié)可能是通過(guò)另一途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明姜黃素能夠降低PGE2的含量，可能是通過(guò)抑制wnt/β-catenin等信號(hào)通路。MACC-1是HGF和c-Met信號(hào)通路的重要調(diào)控者，在原位癌、轉(zhuǎn)移灶等惡性腫瘤中高度表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展、抑制凋亡，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)〔15〕。研究顯示，MACC-1能夠控制Met啟動(dòng)子的活性和表達(dá)，MACC-1轉(zhuǎn)染后能夠誘導(dǎo)Met表達(dá)；MACC-1 siRNA 治療后導(dǎo)致Met 基因被敲除〔1，3〕。研究顯示〔16〕，在胃癌細(xì)胞中MACC-1能夠促進(jìn)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，以研究顯示〔17～19〕評(píng)估胃癌患者M(jìn)ACC-1預(yù)后的重要性存在沖突，包括陰性及預(yù)后不良的影響。研究顯示〔16〕，胃癌患者中MACC-1和Met蛋白過(guò)度表達(dá)與兩者低表達(dá)相比較顯示出低生存率，然而，其他研究顯示〔20〕這兩組在生存率上無(wú)差異。而顯示，MACC-1與總生存率及無(wú)事件生存率的相關(guān)性是獨(dú)立的，而Met與上述指標(biāo)不相關(guān)，也支持一項(xiàng)假說(shuō)——在進(jìn)展期的胃癌患者起重要作用的是MACC-1信號(hào)通路，因此，這項(xiàng)研究顯示在胃癌組織中MACC-1表達(dá)是臨床預(yù)后的不利因素，而不是Met，盡管Met是MACC-1眾所周知的靶基因，但結(jié)果遠(yuǎn)非如此〔21〕。本實(shí)驗(yàn)顯示姜黃素能夠抑制MACC-1及Met蛋白的表達(dá)，呈時(shí)間依賴性，可能是因?yàn)橐种芃ACC-1蛋白表達(dá)，從而影響了HGF/c-Met的信號(hào)通路，抑制了Caco2細(xì)胞的增殖，根據(jù)Wha等〔21〕研究結(jié)果可以推斷，抑制MACC-1蛋白比抑制Met蛋白更有利于結(jié)腸癌患者的預(yù)后。MACC-1可作為結(jié)腸癌患者轉(zhuǎn)移、生存及預(yù)后的生物標(biāo)志物，在Lemos等〔22〕的實(shí)驗(yàn)中首次提出，MACC-1所調(diào)控的信號(hào)通路與腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)性是通過(guò)誘導(dǎo)多樣性干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog、Oct4實(shí)現(xiàn)的，因此，MACC-1能夠促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移可能是通過(guò)干細(xì)胞的信號(hào)通路MACC-1/Nanog/Oct4軸而實(shí)現(xiàn)，為靶向性及干預(yù)治療提供了新的選擇。

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