雙歧桿菌細菌素bif i docin A對大腸桿菌細胞總蛋白表達的影響

劉國榮，李 雪，王成濤*

（北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學，北京 100048）

乳酸菌細菌素是乳酸菌在生長代謝過程中通過核糖體機制合成并分泌到環境中的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質，它在人體內可被降解，具有高效、無抗藥性、無毒、無殘留等優點，已成為益生菌生物活性代謝產物研究與開發的熱點[1]。

對乳酸菌細菌素抑菌作用機制的研究是評價其在食品中應用安全性的重要依據之一。目前已有報道從抑菌作用方式和敏感菌細胞膜通透性等方面開展了乳酸菌細菌素抑菌機理研究[2-3]，已基本明確細菌素對革蘭氏陽性（G+）細菌的主要作用機制是改變敏感菌細胞膜通透性，釋放胞內離子及紫外吸收物質，耗散質子驅動勢，干擾膜運輸，最終引起細胞死亡。但是隨著研究的深入，部分學者發現細菌素對敏感菌的抑菌作用還與其細胞內能量代謝及糖類轉運系統等部分相關蛋白表達有關。如Bendali等[4]通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）發現干酪乳桿菌素處理后李斯特菌細胞內少數蛋白表達量明顯下降，但未對這些蛋白進行鑒定，對造成這種現象的原因也未給出合理解釋；Ramnath等[5]研究發現，細菌素mesentericin Y105對單核細胞性李斯特菌的抑制作用與受體細胞中甘露糖特定磷酸轉移酶系統有關。鑒于此，有必要從蛋白表達水平進一步探究乳酸菌細菌素的抑菌作用機理。

從研究對象看，目前細菌素抑菌機制的研究主要圍繞G+細菌展開，如單核細胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌，而對革蘭氏陰性（G-）細菌的抑菌機制研究報道極少。這是由于多數乳酸菌細菌素僅對近緣的G+細菌有抑菌活性，而只有少數細菌素報道可抑制G-細菌的生長。目前已報道的可以同時抑制G+和G-細菌生長的細菌素有plantaricin ST31[6]、bacteriocin AMA-K[7]、plantaricin MG[8]、sakacin C2[9]、ent35-MccV[10]、lactocin MXJ 32A[11]以及bif i docin A[12]。探究這些廣譜細菌素對G-細菌的抑菌作用機制對于乳酸菌細菌素的開發和利用具有重要科學意義[13]。

動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）BB04分離自中國新疆于田長壽老人腸道，是國內外首次報道的產細菌素動物雙歧桿菌，可代謝合成新型雙歧桿菌細菌素bifidocin A，該細菌素對多株食源性G+和G-病原菌均表現抑菌活性，且食品加工適應性好，有作為天然食品生物防腐劑的巨大應用潛力，前期課題組已對該細菌素的分子結構、特性及合成條件進行了系統研究[12,14]，并從抑菌作用方式、敏感菌細胞膜通透性及細胞結構完整性角度對其抑菌機理進行探索[15-17]。為進一步從蛋白表達水平探討該細菌素對G-菌的抑菌作用機理，本研究采用雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）聯合蛋白質基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜（matrix assisted laser analytical ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術分析細菌素bifidocin A處理前后G-大腸桿菌1.90細胞總蛋白表達差異情況，并在基因本體論（Gene Ontology，GO）注釋基礎上，對差異蛋白進行功能分類及富集分析。研究結果對于全面解析乳酸菌細菌素的抑菌機制具有重要科學意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種及培養基：細菌素bifidocin A純品（質量濃度為1.85 mg/mL，純度為95.3%），產生菌為動物雙歧桿菌（B. animalis）BB04，由本實驗室自主分離提取純化[12-16]；敏感菌：大腸桿菌（Escherichia coli）CGMCC1.90 中國普通微生物菌種保藏管理中心；LB培養基 北京陸橋技術有限責任公司。

IPG膠條（pH 3～10，24 cm）、SYBR Green實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒 美國Bio-Rad公司；RNA提取試劑盒、尿素、硫脲、二硫蘇糖醇、Tris-HCl（pH 8.8）緩沖液、過硫酸銨、礦物油 北京半夏科技有限公司。

1.2 儀器與設備

XO超聲波細胞破碎儀 南京先歐儀器制造有限公司；QL-901旋渦振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PROTEAN IEF Cell等電點聚焦儀、Illumina Eco?實時熒光定量儀 美國Bio-Rad公司；電泳儀、Image Scanner掃描儀 美國GE公司；4800 Plus MALDI TOF MS儀美國AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 敏感菌培養及細菌素bif i docin A處理菌懸液的制備[14]

收集培養至對數生長期的大腸桿菌1.90菌體細胞，用0.1 mol/L（pH 7.0）的羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）緩沖液反復洗滌3 次后，重懸于0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液中，制備成106CFU/mL菌懸液，并向其中加入適量細菌素bif i docin A純品溶液，使最終作用濃度為最低抑菌濃度水平（0.019 mg/mL），37 ℃溫育處理2 h。以未添加細菌素的大腸桿菌菌懸液作為對照。

1.3.2 敏感菌細胞總蛋白提取

取20 mL細菌素處理前后的大腸桿菌菌懸液，4 ℃、10 000 r/min離心10 min去除上清液，用1～2 mL的溶解緩沖液（7 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲，4% 3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內鹽，1%蛋白酶抑制劑）將菌體細胞重懸，反復凍融3 次，在冰上超聲15 min。4 ℃、12 000 r/min離心30 min去除沒有破碎的細菌。通過Bradford法測定蛋白濃度，并在-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3.3 2-DE

1.3.3.1 第1向固相pH梯度等電聚焦電泳（isoelectric focusing，IEF）

將500 μg敏感菌總蛋白提取物溶解在水化液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% 3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內鹽，20 mmol/L二硫蘇糖醇，65 mmol/L Tris，0.2% Bio-Lyte(3-10)，1%溴酚藍）中，使終體積為250 μL。充分混合后將其加入到IPG膠條（pH 3～10，24 cm）內溶脹12 h，然后將IPG膠條放入IEF儀，膠條上滴加一定量的礦物油。按以下參數和程序完成IEF：500 V，1 h；1 000 V，1h；8 000V，4 h；2 000 V，10 h；500 V維持（每膠條電流50 mA）。

1.3.3.2 第2向垂直板SDS-PAGE

將IEF完畢后的IPG膠條分別在平衡緩沖液I（6 mol/L尿素、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）、20%甘油、2% SDS、1%二硫蘇糖醇）和平衡緩沖液II（6 mol/L尿素、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）、20%甘油、2% SDS、2.5%碘乙酰胺）中各平衡15 min；將IPG膠條轉移到SDSPAGE上，用低熔點瓊脂糖封膠液封閉。凝固后進行SDSPAGE，分離膠質量分數為12.5%，濃縮膠按15 mA、分離膠按30 mA進行電泳，至指示線到達膠底部。

1.3.4 凝膠染色及圖像采集分析

SDS膠用考馬斯亮藍G250染色2 h，脫色過夜。圖像采集使用Image Scanner掃描儀掃描凝膠。獲取圖像后，使用PD Quest 8.0對比分析掃描獲得的凝膠圖像，進行蛋白點的辨識以及匹配，比對蛋白豐度，尋找差異蛋白點并進行編號。

1.3.5 差異蛋白MALDI-TOF MS鑒定

從凝膠中切下差異倍數在1.5 倍以上的蛋白點進行MALDI-TOF MS分析，測定前用胰蛋白酶水解樣品。并將所得肽段信息通過Mascot檢索NCBInr數據庫進行蛋白質鑒定。

1.3.6 差異蛋白qRT-PCR分析

為了進一步了解差異表達蛋白對應基因的表達模式，并評價其mRNA水平與蛋白質水平上表達相關性，采用qRT-PCR技術對質譜鑒定出的10 個目標差異蛋白進行了轉錄水平分析。PCR引物根據NCBI提供的序列，采用Primer 3在線設計軟件設計引物，具體信息見表1；選擇編碼大腸桿菌3-磷酸甘油醛脫氫酶gapA作為內參基因，數據分析采用2－ΔΔCt（Livak）法[18]。

表1 qRT-PCR所用引物Table1 Primers used in qRT-PCR

1.3.7 差異蛋白GO注釋分析

檢索GO數據庫的GO號，基于序列相似性，通過BLAST找到與實驗結果序列相似的模式生物蛋白，分別從細胞組成、生物過程和分子功能3 個方面，對差異蛋白質在功能方面進行分類統計。

2 結果與分析

2.1 敏感菌細胞總蛋白2-DE結果

經蛋白定量，大腸桿菌1.90細胞總蛋白樣品的電泳上樣量為1.16 mg/mL。細菌素bifidocin A處理前后大腸桿菌細胞總蛋白的2-DE圖譜如圖1所示，結果顯示，未經細菌素處理的細胞總蛋白2-DE圖譜中共分離到171 個蛋白點，而經細菌素處理后細胞總蛋白樣品共分離到194 個蛋白點，這些蛋白點分子質量分布在10.23～96.67 kDa之間，等電點介于3.45～8.83之間；從等電點（pI）分布來看，大多數蛋白質集中在pI 6.0～8.0之間，其中在pI 3.0～5.0、5.0～6.0和6.0～8.0之間分別有79、51 個和23 個蛋白點；從分子質量分布來看，大部分蛋白點分布在110～30 kDa之間，110～80、80～50 kDa及30～50 kDa的蛋白點分別有25、109 個及23 個。以上結果都說明，細菌素處理前后大腸桿菌細胞總蛋白樣品經2-DE得到了有效分離。

圖1 細菌素bi fi docin A處理前（A）、后（B）大腸桿菌1.90細胞總蛋白的2-DE圖譜Fig.1 2-DE pro fi les of whole proteins extracted from untreated E. coli 1.90 cells (A) and cells treated with bi fi docin A (B)

2.2 敏感菌細胞總蛋白匹配分析

圖2 敏感菌細胞差異蛋白點2-DE圖Fig.2 2-DE images of differentially expressed protein spots from cells treated with bif i docin A

使用PD Quest8.0軟件對不同處理樣品的凝膠圖像進行匹配分析，選取蛋白豐度差異倍數在1.5 倍以上的差異蛋白點，結果見圖2所示。經細菌素處理后大腸桿菌細胞總蛋白表達豐度存在一定差異，共篩選獲得12 個差異蛋白點（圖3）。將上述差異蛋白點通過Quantity Table Reports軟件導出需要的差異蛋白點定量信息，以處理組與對照組樣品中相應蛋白分子質量的比值為灰度值，當灰度值大于1時，認為該蛋白的表達發生了明顯的上調；當灰度值小于1時，認為該蛋白的表達發生了明顯的下調。結果表明，細菌素作用后大腸桿菌1.90細胞總蛋白中有10 個明顯下調蛋白點（9001、3102、7001、1702、3506、7605、2706、7301、1604、2608），2 個明顯上調蛋白點（6203、3205）。

圖3 bif i docin A處理前后大腸桿菌差異蛋白點局部放大圖Fig.3 Close-up of differentially expressed protein spots from E. coli cells untreated and treated with bif i docin A

2.3 差異蛋白質譜鑒定及分析

對12 個差異表達蛋白點進行MALDI-TOF MS分析與鑒定，結果如表2所示。置信區間能達到99%以上的蛋白點有10 個（除3102和3506外），說明這10 個點的測序和鑒定結果比較可靠。其中，2 個表達上調蛋白分別為外膜蛋白OmpA和外膜蛋白OmpW；8 個表達下調蛋白分別為抗酸分子伴侶蛋白HdeA、烷基氫過氧化物還原酶亞基、DNA復制蛋白PriB、分子伴侶蛋白DnaK、延胡索酸還原酶、依賴DNA的RNA聚合酶亞基、肌苷單磷酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶。

表2 MALDI-TOF MS鑒定的差異表達蛋白Table2 Differentially expressed proteins identi fi ed by MALDI-TOF MS

2.4 差異表達蛋白qRT-PCR分析

為了驗證2-DE差異蛋白質組學的分析結果，對10 個差異表達蛋白進行轉錄水平的qRT-PCR驗證，結果見圖4所示，可以看出這些基因的表達水平變化與蛋白表達的上調或下調趨勢一致，但差異表達倍數略微不同。這些結果說明，差異表達蛋白的轉錄水平與蛋白表達水平變化基本一致。

圖4 差異表達蛋白的qRT-PCR分析Fig.4 qRT-PCR assay of differentially expressed proteins

2.5 差異表達蛋白的GO功能注釋

圖5 差異表達蛋白的GO功能分類統計Fig.5 Gene ontology prof i les of differentially expressed proteins

如圖5所示，涉及細胞組成的有2 個蛋白，分別為外膜蛋白OmpA和外膜蛋白OmpW，它們都與維持細胞膜形態和結構有關[19-21]，這與之前本課題組從細胞水平揭示的細菌素抑菌機理一致，細菌素作用的主要部位是在敏感菌細胞膜上[14]。涉及生物過程有7 個蛋白，分別為抗酸分子伴侶蛋白HdeA、烷基氫過氧化物還原酶AhpR、DNA復制蛋白PriB、分子伴侶DnaK、延胡索酸還原酶、肌苷單磷酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶，其中，延胡索酸還原酶和琥珀酸脫氫酶參與三羧酸循環中延胡索酸和琥珀酸之間的轉化[22-23]，肌苷單磷酸脫氫酶是核苷酸合成途徑的關鍵酶[24]，細菌素處理后這3 個蛋白的表達量都降低，說明細菌素可能一定程度阻斷了敏感菌細胞的三羧酸循環，減少三磷酸腺苷合成前體，從而降低能量提供，這與之前從細胞膜通透性角度揭示的細菌素抑菌機理一致，細菌素處理后敏感菌胞內能量代謝受到影響，三磷酸腺苷含量明顯下降[14]；抗酸分子伴侶蛋白HdeA、烷基氫過氧化物還原酶AhpR和分子伴侶DnaK都是作為全局脅迫調節子適應脅迫條件的蛋白質[25-28]，細菌素處理后這些蛋白表達量的降低，說明細菌素處理后細胞對外界脅迫條件的抵抗能力下降；DNA復制相關蛋白PriB，是大腸桿菌中參與DNA復制重啟反應的相關蛋白[29-30]，其表達量下降說明細菌素可能對敏感菌DNA復制功能有影響。涉及細胞基因轉錄過程的有1 個蛋白，為依賴DNA的RNA聚合酶。

3 結 論

本研究采用2-DE聯合蛋白質MALDI-TOF MS技術分析細菌素bif i docin A處理前后G-大腸桿菌1.90細胞總蛋白表達差異情況，并對差異表達蛋白進行GO功能分類及富集分析，旨在從蛋白表達水平進一步探討該細菌素對G-菌的抑菌作用機理。研究結果顯示細菌素bif i docin A可能是通過改變細胞膜結構、阻斷三羧酸循環、減少能量及ATP提供以及降低細胞對外界脅迫條件的抵抗能力等來達到對敏感G-菌的抑菌效果。但是，細菌素對差異表達蛋白的具體作用機制以及差異表達蛋白之間的相互關系仍然不明確，未來需要進一步探索研究。