嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)環(huán)節(jié)蠟樣芽孢桿菌分離株多位點(diǎn)序列分型分析

劉 陽(yáng)，葛武鵬,*，張 靜，郭春鋒，梁秀珍，王 智，張興吉，王 瑞

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省飛天乳業(yè)有限公司，陜西 寶雞 721100；3.陜西百躍優(yōu)利士乳業(yè)有限公司，陜西 咸陽(yáng) 712000）

蠟樣芽孢桿菌屬由多個(gè)生理生化特性高度相似的革蘭氏陽(yáng)性菌群組成，主要包括蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、炭疽芽孢桿菌（B. anthraics）、蕈狀芽孢桿菌（B. mycoides）、假蕈狀芽孢桿菌（B. pseudomycoides）、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）、細(xì)胞毒素芽孢桿菌（B. cytotoxicus）、圖瓦永芽孢桿菌（B. toyonensis）及韋氏芽孢桿菌（B.weihenstephanensis）8 種[1-2]。其中B. cereus因產(chǎn)高黏附能力的孢子而在自然界中廣泛存在，是一種易引起人畜共患疾病的病原菌[3]，主要代謝物有嘔吐毒素、細(xì)胞毒素K、溶血性腸毒素BL和非溶血性腸毒素等，可引起嘔吐、腹瀉等臨床癥狀，在中國(guó)因其引發(fā)的食物中毒事件總量?jī)H次于沙門(mén)菌，嬰幼兒等低免疫人群感染后可誘發(fā)心膜炎、菌血癥和腦膜炎等并發(fā)癥，甚至危及生命[4-7]。乳粉生產(chǎn)工藝中的巴氏殺菌、超高溫瞬時(shí)殺菌、濃縮、噴霧干燥等環(huán)節(jié)可確保殺滅蠟樣芽孢桿菌等所有致病微生物的菌體細(xì)胞，但具有耐熱特性的孢子極易在特定條件下萌發(fā)，轉(zhuǎn)為繁殖細(xì)胞，使其代謝產(chǎn)物在終產(chǎn)品中存在而誘發(fā)食源性疾病[8-9]。在食品安全管控中生物性危害在各國(guó)均是最為嚴(yán)苛的，在我國(guó)各類(lèi)食品中亦有嚴(yán)格限量規(guī)定，特別是嬰幼兒配方食品[10-11]。我國(guó)規(guī)定不同食品中蠟樣芽孢桿菌的菌落總數(shù)應(yīng)小于103～105CFU/g（CFU/mL），并且其在嬰幼兒配方食品中作為致病風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)也是主要監(jiān)控的生物性危害之一[12-13]。近年來(lái)有關(guān)B. cereus的研究主要集中在糧食類(lèi)餐食方面，如有學(xué)者[14-15]研究了炒米飯和大米分離株的毒力基因、致病機(jī)理、基因進(jìn)化關(guān)系，有關(guān)嬰幼兒配方食品的研究大多體現(xiàn)在對(duì)其分離株及其毒力基因表達(dá)上，而關(guān)注于生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)的研究偏少，特別是對(duì)于羊奶粉加工環(huán)節(jié)得到的分離株基因進(jìn)化關(guān)系的研究更是鮮見(jiàn)報(bào)道[16]。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplification polymorphic DNA，RAPD）采用一條隨機(jī)引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，可用于較大樣本量的初步分型，但無(wú)法得到分離株之間的基因進(jìn)化關(guān)系[17-19]。多位點(diǎn)序列分型（multiple locus sequence typing，MLST）是一種基于7 個(gè)管家基因的分子分型技術(shù)，其采用雙向測(cè)序以得到精確、分辨率較高的結(jié)果，運(yùn)用非加權(quán)平均數(shù)（unweight pair-group method using arithmetic averages，UPGMA）、基于相關(guān)序列（based upon related sequence types，BURST）等算法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分型分析，且建有實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)全球共享的平臺(tái)——MLST國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)（PubMLST Database）[20-22]。該數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了B. cereus、金黃色葡萄鏈球菌（Staphylococcus aureus）、白色念珠菌（Candida albicans）等108 種微生物以及噬菌體、質(zhì)粒的MLST方案，其中B. cereus的PubMLST Database建立于2004年，實(shí)現(xiàn)了不同國(guó)家、不同地區(qū)、不同實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比對(duì)和溯源性分析，使得臨床和食源性分離株的遺傳多樣性得到廣泛研究[6,23]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)經(jīng)RAPD初步分型得到的42 株B. cereus進(jìn)行MLST分型分析，探究出嬰幼兒配方羊乳粉加工生產(chǎn)環(huán)節(jié)得到的分離株的基因多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為其溯源和有效防控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

2016年7月—2016年11月于陜西省A、B、C三家羊乳粉廠采集嬰幼兒配方粉各生產(chǎn)環(huán)節(jié)及工廠周邊土壤樣共計(jì)970 份，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）分子鑒定得到B. cereus分離株350 個(gè)，保存于-80 ℃冰箱備用。

本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控菌株為B. c e r e u s標(biāo)準(zhǔn)菌株CGMCC1.1846。

1.1.2 MLST分型菌株的來(lái)源

采用RAPD技術(shù)對(duì)350 株陽(yáng)性菌初步分型，聚類(lèi)分析后得到8 個(gè)獨(dú)立株和12 簇（相似度≥95%），將所有獨(dú)立株（8 個(gè)）和隨機(jī)選取各簇的3 株菌（34 個(gè)）進(jìn)行MLST基因分型。本研究所用的分離株是經(jīng)RAPD初步分型得到的。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

胰酪胨大豆多黏菌素肉湯基礎(chǔ)、甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂基礎(chǔ)、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、腦心浸液肉湯（BHI） 北京陸橋技術(shù)有限公司。

多黏菌素B、50%卵黃液 北京陸橋技術(shù)有限公司；乙二胺四乙酸、Tris 美國(guó)Sigma公司；瓊脂糖美國(guó)HydraGene公司；PCR Premix Taq、引物 日本Takara公司；DuRed核酸染料 北京泛博生化有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T100TMThermal Cycler PCR儀、GEL DOC XR凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；SB4200DT移液器 德國(guó)Eppendorf公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DH-500電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 分離株DNA的提取

將保存的B. cereus分離菌株接種于BHI培養(yǎng)基于30 ℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速180 r/min），取2 mL培養(yǎng)好的菌懸液于無(wú)菌離心管以5 000×g離心5 min，棄上清液，加1 mL TE緩沖液重懸，將重懸液以5 000×g離心5 min，棄上清液后再取100 μL TE緩沖液重懸，100 ℃熱裂解20 min，裂解后立即冰浴10 min，再以13 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上清液即為DNA模板，于-20 ℃保存?zhèn)溆肹25]。

1.3.2 MLST基因分型

根據(jù)PubMLST Databases中B. cereus的MLST方案（http://pubmlst.org/bcereus/info/primers.shtml），對(duì)初步分型得到的42 株目標(biāo)菌的7 個(gè)管家基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，從而得到相應(yīng)的序列類(lèi)型。

1.3.2.1 管家基因片段擴(kuò)增

B. cereus的7 個(gè)管家基因的擴(kuò)增引物如表1所示。

表1 B. cereus管家基因Table1 Seven house-keeping genes of B. cereus

反應(yīng)體系5 0 μ L：D N A模板5 μ L，PCR Premix Taq 25 μL，正向引物和反向引物各1 μL（終濃度0.2 μmol/L），超純水18 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56～59 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，終產(chǎn)物4 ℃保藏。取擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行110 V恒壓電泳35 min，在凝膠成像系統(tǒng)中得到DNA指紋圖譜，將成像結(jié)果是目標(biāo)條帶單一清晰且無(wú)非特性雜帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3.2.2 等位基因及基因序列的上傳比對(duì)

將7 個(gè)管家基因的正反雙向引物擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接并上傳至PubMLST Database進(jìn)行基因序列比對(duì)，得到相應(yīng)的Aelle ID，將比對(duì)過(guò)的7 個(gè)等位基因序列號(hào)上傳后得到相應(yīng)的序列類(lèi)型MLST profiles。對(duì)于有基因變異和多態(tài)性位點(diǎn)變異的序列，向數(shù)據(jù)庫(kù)提交新序列分離株的信息并申請(qǐng)分離株號(hào)（PubMLST ID），申請(qǐng)并提交相應(yīng)的新型基因的驗(yàn)證信息，得到新型的等位基因和序列類(lèi)型。

1.3.2.3 MLST克隆復(fù)合物（clonal complex，CC）的聚類(lèi)分析

使用BioNumerics vision 7.6處理42 株分離株的等位基因和序列類(lèi)型，建立最小生成樹(shù)，同時(shí)按照UPGMA算法構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)，分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用BioNumerics version 7.6完成序列的拼接和與已上傳數(shù)據(jù)的序列比對(duì)，得到不同的ST型，以UPGMA法建立不同ST型的聚類(lèi)樹(shù)；將本研究得到的分離株基因序列與國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)PubMLST Database中的基因序列比對(duì)分析，采用在線BURST（n-4）算法進(jìn)行分離株CC的聚類(lèi)分析，使用Phylo Tree建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 管家基因PCR結(jié)果

圖1 B. cereus七個(gè)管家基因的凝膠成像圖Fig.1 PCR amplif i cation of house-keeping genes from B. cereus isolates

不同管家基因的特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物凝膠成像如圖1所示，特異性引物均能擴(kuò)增出單一清晰的目標(biāo)條帶。MLST方案中有3 個(gè)備選引物，劉勇[15]使用備選引物ilvD_2（F：5’-AGATCGTATTACTGCTACGG-3’；R：5’-GTTACCATTTGTGCATAACGC-3’）對(duì)大米中致吐型B. cereus進(jìn)行MLST分型擴(kuò)增，而本研究只使用基于基本方案的引物進(jìn)行擴(kuò)增，主要原因可能是前者研究的目標(biāo)基因是嘔吐型毒素，而ilvD_2是針對(duì)產(chǎn)嘔吐毒素分離株設(shè)計(jì)的特異性引物。Li Fan等[25]研究表明不同的食物得到的分離株具有不同的毒力基因，而我國(guó)食源性B. cereus分離株的毒力基因主要是腸毒素基因。由此初步推斷陜西省嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)鏈中的B. cereus分離株沒(méi)有產(chǎn)嘔吐素的典型基因。

2.2 MLST分型結(jié)果

圖2 42 株B. cereus分離株ST型聚類(lèi)樹(shù)Fig.2 Clustering dendrogram of 42 B. cereus isolates

42 株分離株MLST分型的結(jié)果如圖2所示，共7 個(gè)ST型，分別為ST-1348、ST-1349、ST-1350、ST-1351、ST-1084、ST-1000和ST-770，其MLST CC有142、205和23三種。4 個(gè)成品粉分離株的基因型為ST-1084，其余2 個(gè)為ST-1000。Yang Yong等[16]采用MLST技術(shù)對(duì)中國(guó)嬰幼兒食品B. cereus分離株分型，得出ST-1062的菌株為中國(guó)羊乳特征分離株，而本研究的分離株并沒(méi)有得到具有此基因型的菌株；與此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)所用的原料羊乳樣品經(jīng)分離鑒定后，發(fā)現(xiàn)其污染率為0%（0/15），因此可排除原料羊乳是嬰幼兒配方羊乳粉污染B. cereus源頭的可能。Kovac等[26]將乳源分離株通過(guò)MLST分析分為21 個(gè)不同的ST型，其中有16 個(gè)新的基因型，本研究將得到的嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)鏈分離株分為7 個(gè)ST型，其中ST-1348、ST-1349、ST-1350、ST-1351為4 個(gè)新型ST型，glp-253、glp-254、ilv-277、pyc-199為4 個(gè)新型等位基因；此外，PubMLST Database數(shù)據(jù)顯示[27]，從2015年我國(guó)乳制品分離株首次上傳至今已有70 個(gè)乳源分離株在庫(kù)，分為68 個(gè)ST型（圖3），本研究得到的ST-1348、ST-1049、ST-1051包含在內(nèi)，表明乳制品分離株具有遺傳多樣性。因此，本研究基因序列的進(jìn)化關(guān)系需要進(jìn)行進(jìn)一步BURST（n-4）和MLST CC分析。

圖3 我國(guó)乳制品B. cereus分離株[28]的ST型及進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Sequence types and phylogenetic tree of B. cereus strains isolated from milk products in China

2.3 MLST CC分析結(jié)果

將42 株分離株的ST型及其CC建立最小生成樹(shù)，如圖4所示，ST-1000隸屬CC 142，ST-1084隸屬于CC 205，ST-770與ST-1084與其他ST型相比具有較近的親緣關(guān)系，ST-1348隸屬于CC 23。

將本研究得到的ST-770、ST-1000、ST-1084、ST-1348、ST-1349、ST-1350、ST-1351與其CC ST-142、ST-23運(yùn)用數(shù)據(jù)庫(kù)在線BURST（n-4）工具分為3 組（Group）和3 個(gè)獨(dú)體，ST-23和ST-1348同屬Group 1，ST-142、ST-1000同屬Group 2，ST-770、ST-1084、ST-205同屬Group 3，獨(dú)體ST-1349和獨(dú)體ST-1350分別是上粉器內(nèi)壁分離株3L33和土壤分離株3L47的基因型，獨(dú)體ST-1351是純羊奶粉分離株1Y55、乳糖粉分離株1Y58、輔料室地面分離株5L45的基因型。BURST的結(jié)果與最小生成樹(shù)的結(jié)果一致，相互驗(yàn)證分離株的親緣進(jìn)化關(guān)系。Dohmae等[28]的研究闡明B. cereus食源性分離株的基因型主要為ST-26、ST-142、ST-381，本研究得到的ST-1000（與ST-142基因型同屬）與其基因型一致。張翼[29]采用MLST技術(shù)將11 株產(chǎn)嘔吐毒素的分離株的基因型分為ST-26和ST-989，并使用BURST工具探究其親緣關(guān)系，其與本研究使用的分析方法相同，但沒(méi)有得到相同的ST型，這可能是因?yàn)閶胗變号浞窖蛉榉凵a(chǎn)鏈的分離株不表達(dá)致嘔吐毒素的基因[21]。

圖4 42 株B. cereus分離株的最小生成樹(shù)Fig.4 Minimum spanning tree of 42 B. cereus isolates

2.4 不同來(lái)源分離株ST型的比對(duì)分析

我國(guó)已上傳至PubMLST Database的B. cereus分離株共153 個(gè)，與之對(duì)應(yīng)的基因型有126 個(gè)，其中包括本研究得到的ST-1348（分離株3L4）、ST-1349（分離株3L33）、ST-1350（分離株3L47）、ST-1351（分離株1Y55、5L45、1Y58）4 個(gè)基因型，使用n-4的BURST將我國(guó)不同來(lái)源B. cereus分離株的ST型分為10 個(gè)組和12 個(gè)獨(dú)株。Group 1是以ST-26為祖先克隆的主體群屬（72.2%，91/126），Vassileva等[7]研究發(fā)現(xiàn)ST-26為典型的產(chǎn)嘔吐毒素的基因型，此基因型與本研究得到的ST型無(wú)重疊，驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)2.1節(jié)的初步推斷。ST-1048與ST-1348同屬Group 5，均為ST-23的克隆復(fù)合物，其分離株的來(lái)源均為中國(guó)乳制品，后者采自陜西省嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)鏈的濃縮車(chē)間，Barker等[30]探究了臨床分離株的致病性與MLST的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)誘發(fā)菌血癥的B. cereus分離株的ST型與B. thuringiensis的ST型具有同源性，本研究得到的MLST CC 23是B. thuringiensis的ST-23，其分離株3L4（濃縮車(chē)間平皿沉降樣）有可能是誘發(fā)菌血癥的菌株；ST-1140和ST-1350同屬Group 7，其分離株來(lái)源均為陜西省土壤樣，后者采自陜西省羊乳粉生產(chǎn)工廠周邊的土壤；ST-1227、ST-1311、ST-1351同屬Group 10，其分離株來(lái)源分別為食品包裝、陜西省土壤樣、嬰幼兒羊乳粉生產(chǎn)鏈分離株；ST-1349是獨(dú)株，其分離株3L33采自嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)鏈的上粉器內(nèi)壁。

表2 嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)鏈B. cereus分離株ST型的同源關(guān)系[28]Table2 Evolutionary relationships of STs for B. cereus strains isolated from goat milk infant formula processing plants

用BURST（n-4）比對(duì)了全世界B. cereus分離株，得到27 個(gè)組和33 個(gè)獨(dú)株，進(jìn)一步分析本研究所得的所有基因型的同源關(guān)系，如表2所示。ST-1000、ST-1084、ST-770、ST-1351同屬以ST-142為祖先克隆Group 1，其中ST-1084從屬以ST-205為首的亞克隆復(fù)合物；ST-1348從屬以ST-56為祖先克隆的Group 4（圖5）；ST-1349與ST-57、ST-76同屬Group 7。

圖5 ST-1348的進(jìn)化關(guān)系及其所屬Group 4的2 個(gè)亞克隆復(fù)合物Fig.5 Evolutional relationship of STs in Group4 isolated from different sources around the world and its2 sub-clonal complexes

3 結(jié) 論

嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)環(huán)節(jié)的B. cereus分離株共分為7 個(gè)ST型，分別為ST-770（4.8%，2/42）、ST-1000（71.4%，30/42）、ST-1084（9.5%，4/42）、ST-1348（2.4%，1/42）、ST-1349（2.4%，1/42）、ST-1350（2.4%，1/42）和ST-1351（7.1%，3/42），其中ST-1000是嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)環(huán)節(jié)分離株的主要ST型；發(fā)現(xiàn)了4 個(gè)新的ST型和4 個(gè)新的等位基因，上傳至PubMLST Database得到新的序列號(hào)和等位基因號(hào)，分別是ST-1348、ST-1349、ST-1350、ST-1351和glp-253、glp-254、ilv-277、pyc-199。嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)環(huán)節(jié)B. cereus分離株的基因具有多樣性；嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)環(huán)節(jié)分離株的ST型被識(shí)別為205、142、23三個(gè)不同克隆譜系，2 個(gè)單態(tài)群（ST-770和ST-1351）和2 個(gè)獨(dú)株（ST-1348和ST-1349），其祖先克隆復(fù)合物為142，沒(méi)有得到典型致嘔吐基因型ST-26或其同源克隆復(fù)合物，而可能引起菌血癥的基因型ST-1348在濃縮車(chē)間的空氣樣中檢出。新的ST-1349、ST-1350無(wú)祖先克隆復(fù)合物，表現(xiàn)出進(jìn)化變異。