當(dāng)歸黃芪湯對糖尿病大鼠腎組織JAK2STAT3信號通路的影響

呂 娟，曹蘭秀

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室，陜西 西安 712046）

糖尿病腎病（DN）作為糖尿病最嚴(yán)重的一類并發(fā)癥，當(dāng)前仍未完全闡明其發(fā)病機(jī)制，氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致此種并發(fā)癥的關(guān)鍵因素[1]。酪氨酸激酶-信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（tyrosine kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK2STAT3）信號通路發(fā)生的活化可能對DN的發(fā)展有促進(jìn)作用[2]。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病患者大都?xì)怅巸商摚已鲇诿}。當(dāng)歸黃芪湯是由當(dāng)歸和黃芪進(jìn)行配伍的中醫(yī)古方，可發(fā)揮較好的益氣活血功效，治療糖尿病有一定療效，但相關(guān)報道并未涉及當(dāng)歸黃芪湯對JAK2STAT3信號通路的影響[3]。本研究中分析了當(dāng)歸黃芪湯對糖尿病大鼠的腎組織JAK2STAT3信號通路產(chǎn)生的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：AU400型全自動生化分析儀（日本Olympus公司）；UV 2000型紫外-可見分光光度計（尤尼科上海公司）；9602A型酶標(biāo)儀（北京艾普華美生物科技有限公司）；蛋白印跡及電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

試藥：超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA）試劑盒，均購自深圳晶美公司；兔抗大鼠磷酸化酪氨酸激酶（p-JAK2）及磷酸化信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（p-STAT3）型多克隆抗體，均購自武漢博士德公司；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）。

動物與分組：選擇我校2017年6月實驗室飼養(yǎng)的清潔級Wistar大鼠90只，均為雄性，8周齡，均購自北京維通利華公司，許可證號為SCXK<京>2014-0001。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分成觀察組、模型組和對照組，各30只。其中，觀察組大鼠的體質(zhì)量為200～225 g，平均（212．34 ±2．16）g；模型組大鼠為 202 ～223 g，平均（211．98±2．30）g；對 照 組 大鼠為 205 ～220 g，平均（212．18 ±2．24）g。各組大鼠的周齡、性別及體質(zhì)量相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），具有可比性。本研究經(jīng)我校動物實驗倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

模型建立及藥物干預(yù)：所有大鼠在相同條件下飼養(yǎng)1周，禁食12 h，模型組及觀察組大鼠建立糖尿病模型，腹腔內(nèi)注射60 mg/kg STZ溶液，對照組大鼠腹腔內(nèi)注射相同劑量的檸檬酸液。72 h后，測定模型組及觀察組大鼠的空腹血糖，超過16．7 mmol/L為建模成功。建模成功后第2天，灌胃給藥，觀察組大鼠給予3．6 g/（kg·d）的當(dāng)歸黃芪湯（稱取當(dāng)歸6 g和黃芪30 g，加入蒸餾水200 mL，煮沸約 0．5 h，過濾，收集藥液，藥渣內(nèi)加入蒸餾水200 mL，煮沸 0．5 h，過濾，收集藥液，合并2次收集的藥液，蒸發(fā)并濃縮至100 mL，最終質(zhì)量濃度為0．36 g/mL），每日1次；模型組及對照組大鼠均給予等量蒸餾水，1次/日。均連續(xù)給藥12周。

1.3 觀察指標(biāo)

12周后，對比3組大鼠腎功能指標(biāo)，包括24 h尿蛋白定量（24 hPRO）、尿素氮（BUN）及血肌酐（SCr）水平；腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)，包括超氧化物歧化酶（SOD）及丙二酶（MDA）；大鼠腎組織的JAK2STAT3信號通路情況，包括磷酸化酪氨酸激酶（p-JAK2）及磷酸化信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（p-STAT3），分析JAK2STAT3信號通路與腎功能及氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性。

腎功能指標(biāo)：以代謝籠采集大鼠在24 h內(nèi)的尿液，考馬斯亮藍(lán)G250法測定24 hPRO水平，再經(jīng)腹主動脈采集血液標(biāo)本2 mL，3 000 r/min離心10 min后提取血清，通過全自動生化分析儀測定BUN及SCr水平。

腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)：提取大鼠的腎臟組織1 g，以生理鹽水配置10%質(zhì)量體積比的腎組織勻漿，行3 000 r/min離心5 min后，提取上清液，根據(jù)試劑盒說明書測定腎組織SOD及MDA水平。

腎組織JAK2STAT3信號通路：提取大鼠的腎臟組織1 g，添加組織裂解液，3 000 r/min離心5 min，提取上清液，通過WesternBlot法及有關(guān)試劑盒測定p-JAK2及p-STAT3的表達(dá)情況，嚴(yán)格遵守說明書步驟逐步操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21．0統(tǒng)計軟件分析。計數(shù)資料以百分率（% ）表示，行 χ2檢驗；計量資料以±s表示，行 t檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見表1至表4。經(jīng)Spearman法分析相關(guān)性，可知p-JAK2及 p-STAT3均分別與 24 hPRO，BUN，SCr及MDA 呈正相關(guān)（P＜0．05），與 SOD呈負(fù)相關(guān)（P＜0．05）。

表1 大鼠腎組織JAK2STAT3信號通路與腎功能及氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性分析（r，P）

表2 3組大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s，n=30）

表2 3組大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s，n=30）

注：與對照組比較，*P=0．000；與模型組比較，#P=0．000。表 3、表4同。

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表3 3組大鼠腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s，n=30）

表3 3組大鼠腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s，n=30）

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3 討論

糖尿病患者的病程超過15年后通常會發(fā)生腎臟損傷，隨著病情進(jìn)展，可能會出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿，且較難逆轉(zhuǎn)，最后可進(jìn)行性地引發(fā)終末期腎功能衰竭等癥狀[4]，早期干預(yù)十分必要。當(dāng)歸黃芪湯由5∶1比例的黃芪和當(dāng)歸組方，也是我國傳統(tǒng)補氣養(yǎng)血的重要方劑，對勞倦內(nèi)傷和氣弱血虛，以及陽浮外越等癥狀療效較好。糖尿病患者應(yīng)用當(dāng)歸黃芪湯有助于發(fā)揮其補氣養(yǎng)血的功效[5]，但是否對腎組織有保護(hù)作用值得深入研究。

表4 3組大鼠腎組織JAK2STAT3表達(dá)水平比較（±s，n=30）

表4 3組大鼠腎組織JAK2STAT3表達(dá)水平比較（±s，n=30）

p-STAT3/GAPDH 0．24 ± 0．03*#0．28 ±0．05*0．09 ±0．02 4．357 0．003組別觀察組模型組對照組F值P值p-JAK2/GAPDH 0．23 ± 0．05*#0．35 ±0．04*0．13 ±0．03 5．891 0．001

本研究結(jié)果顯示，觀察組及模型組大鼠的24 hPRO，BUN，SCr水平均明顯高于對照組大鼠，但觀察組大鼠明顯低于模型組大鼠（P＜0．05），提示當(dāng)歸黃芪湯對大鼠的腎功能具有較好的保護(hù)作用。分析原因，可能是因為當(dāng)歸黃芪湯降低了腎小球及腎小管內(nèi)的轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達(dá)，并有效降低了細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，抑制了腎臟肥大的進(jìn)展，最終起到一定的腎保護(hù)作用[6-8]。糖尿病初期通常會出現(xiàn)燥熱傷陰等癥狀，伴隨病情的進(jìn)展，逐漸導(dǎo)致陰傷及氣，并引起氣陰兩虛。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣是血之帥，若氣虛則機(jī)體將無力運血，血行不暢，且瘀于脈中，故糖尿病的治療以益氣養(yǎng)陰活血為重。方中黃芪可發(fā)揮補氣固表和利尿托毒等功效，當(dāng)歸可發(fā)揮補血活血等功效，二者聯(lián)用共奏益氣活血之功效，有助于延緩腎臟的纖維化進(jìn)程，最終發(fā)揮腎保護(hù)作用。觀察組及模型組大鼠腎組織的SOD水平均明顯低于對照組，觀察組明顯高于模型組；MDA水平均明顯高于對照組，觀察組明顯低于模型組（P＜0．05），提示當(dāng)歸黃芪湯能較好地緩解糖尿病導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。原因可能與當(dāng)歸黃芪湯可幫助機(jī)體控制血糖水平的明顯上升，并最終減少了糖基化終產(chǎn)物的受體表達(dá)等因素有關(guān)[9-10]。糖基化終產(chǎn)物所介導(dǎo)的此種受體參與了糖尿病大鼠腎組織氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制，而持續(xù)性高血糖狀態(tài)對此種受體的表達(dá)具有促進(jìn)作用。當(dāng)歸黃芪湯能較好地阻斷或延緩此種受體的表達(dá)進(jìn)程，最終緩解了機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷。此外，觀察組及模型組大鼠腎組織的p-JAK2及p-STAT3表達(dá)均明顯高于對照組，但觀察組又明顯低于模型組（P＜0．05），提示當(dāng)歸黃芪湯能抑制JAK2STAT3信號通路的異常激活狀態(tài)。可能是因為當(dāng)歸黃芪湯通過延緩了在高血糖條件下的氧化應(yīng)激，進(jìn)而防止了JAK2STAT3信號通路的異常激活。當(dāng)歸黃芪湯通過降糖和緩解氧化應(yīng)激損傷等作用調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，能間接地誘導(dǎo)JAK2及STAT3產(chǎn)生磷酸化反應(yīng)，進(jìn)而激活JAK2STAT3信號通路的異常活化，最終發(fā)揮了較好的治療效果。Spearman法分析相關(guān)性后顯示，p-JAK2 及 p-STAT3 均分別與 24 hPRO，BUN，SCr，MDA呈正相關(guān)（P＜0．05），與 SOD 呈負(fù)相關(guān)（P＜0．05），再次證實了JAK2STAT3信號通路與糖尿病大鼠的腎功能及氧化應(yīng)激指標(biāo)之間聯(lián)系緊密，與文獻(xiàn)[11-12]的報道結(jié)果相同。

綜上所述，當(dāng)歸黃芪湯能抑制JAK2STAT3信號通路的異常激活狀態(tài)，通過其降糖和緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷而實現(xiàn)。臨床對JAK2STAT3信號通路的常規(guī)監(jiān)測有助于綜合評價治療效果，值得推廣。